盧秋梅,黎 倩,黃艷霞,栗建明
(1. 廣州市藥品檢驗(yàn)所·國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510160;2. 廣州康臣藥業(yè)有限公司,廣東 廣州 510635)
益腎化濕顆粒為廣州康臣藥業(yè)有限公司獨(dú)家品種,處方源自《脾胃論》中的升陽益胃湯,由人參、黃芪、黃連等16 味中藥組方[1],功效為升陽補(bǔ)脾、益腎化濕、利水消腫,用于脾虛濕盛證所致蛋白尿,兼見水腫、疲倦乏力、畏寒肢冷、納少等證[2]。該方傳統(tǒng)劑型為湯劑,不易貯存及攜帶,顆粒劑克服了湯劑的不足,具有穩(wěn)定、易攜帶的特點(diǎn)[3]。目前,該藥僅有局頒標(biāo)準(zhǔn)(國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ04482009)。在此基礎(chǔ)上,本研究中新增了人參的薄層色譜(TLC)鑒別和黃芪中黃芪甲苷的高效液相色譜(HPLC)法含量測定,修訂了人參的HPLC 含量測定方法(增加人參皂苷Rg1和Re 指標(biāo)),完善了黃芪、獨(dú)活、甘草、白芍、黃連和陳皮的TLC 鑒別方法?,F(xiàn)報(bào)道如下。
P300H 型超聲波清洗器(德國Elma 公司,功率為300 W,頻率為37 kHz);TLC 板加熱器,TLC Visualizer薄層成像系統(tǒng)(瑞士Camag 公司);XP26 型電子天平(精度為0.1 mg);MS204S 型電子天平(精度為0.001 mg),均購自瑞士Mettler Toledo 公司;ST16 型高速離心機(jī)(美國賽默飛公司);TW12 型恒溫水浴鍋(德國Julabo 公司);硅膠G60 薄層板(德國Merck 公司);1260Ⅱ型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),包括Alltech 6000 蒸發(fā)光散射檢測器,Openlab CDS 2.2 色譜工作站。
益腎化濕顆粒(批號(hào)分別為20180608,20180609,20180701,規(guī)格為每袋10 g)及所有陰性樣品均購自廣州康臣藥業(yè)有限公司;對(duì)照藥材黃芪(批號(hào)為120974 -201612)、人參(批號(hào)為120917 -201712)、獨(dú)活(批號(hào)為120940 -201612)、甘草(批號(hào)為120904 -201620)、白芍(批號(hào)為120905 -201610)、黃連(批號(hào)為120913 -201611)、陳皮(批號(hào)為120969 -201510),以及對(duì)照品人參皂苷Rg1(批號(hào)為110703 -201832)、人參皂苷Re(批號(hào)為110754 -201827)、人參皂苷Rb1(批號(hào)分別為110704 -201726,110704 -201827)、黃芪甲苷(批號(hào)為110781 -201717)、芍藥苷(批號(hào)為110736 -201842)、鹽酸小檗堿(批號(hào)為110713 -201814)、橙皮苷(批號(hào)為110721 -201818)、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯(批號(hào)為111583 -201304),均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為純化水。
人參、黃芪:取本品4 g,加水40 mL 溶解,離心,取上清液,用乙醚萃取3 次,每次30 mL,合并乙醚液(備用),分取水溶液(溶液1)10 mL,用水飽和正丁醇振搖提取3 次,每次10 mL,合并正丁醇液,用氨試液提取3 次,每次30 mL,棄去氨試液,正丁醇蒸干,殘?jiān)蛹状? mL 使溶解,作為供試品溶液。取人參對(duì)照藥材0.5 g,黃芪對(duì)照藥材1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。分別取缺人參、黃芪的陰性樣品適量,同法制得缺人參、黃芪陰性對(duì)照品溶液。取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及黃芪甲苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液1 ~2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨液(5→50,4 ∶1 ∶5,V/ V/ V)的上層溶液為展開劑,另槽加入10 mL 濃氨試液,預(yù)平衡15 min,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置日光及紫外光(365 nm)下檢視。色譜圖見圖1。可見,供試品溶液色譜中,在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn),陰性對(duì)照無干擾。
圖1 人參、黃芪薄層色譜圖
圖2 甘草、黃連、陳皮薄層色譜圖
甘草:取水溶液1,用水飽和正丁醇振搖提取3 次,每次20 mL,合并正丁醇液,正丁醇蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材0.5 g,加水40 mL,煎煮30 min,濾過,取濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺甘草陰性樣品適量,同法制得缺甘草陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上使成條帶狀,以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15 ∶1 ∶1 ∶2,V/ V/ V/ V)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,日光下檢視。色譜圖見圖2 A??梢?,供試品溶液色譜中,在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照無干擾。
黃連:取本品4 g,加95%乙醇15 mL,超聲30 min,過濾,濾液濃縮至5 mL,作為供試品溶液(溶液2)。取黃連對(duì)照藥材0.2 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺黃連陰性樣品適量,同法制得缺黃連陰性對(duì)照品溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液,作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上使呈條帶狀,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水(6 ∶3 ∶2 ∶1.5 ∶0.3,V/ V/ V/ V/ V)為展開劑,另槽加入10 mL 濃氨試液,預(yù)平衡15 min,展開,取出,晾干,置紫外光(365 nm)下檢視。色譜圖見圖2 B。可見,供試品溶液色譜中,在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對(duì)照無干擾。
陳皮:取陳皮對(duì)照藥材0.3 g,加95%乙醇15 mL,超聲30 min,過濾,濾液蒸干,定容至5 mL,作為對(duì)照藥材溶液。取缺陳皮陰性樣品適量,同法制得缺陳皮陰性對(duì)照品溶液。取橙皮苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL 含0.4 mg 的溶液,作為對(duì)照品溶液。吸取溶液2、對(duì)照藥材溶液及缺陳皮陰性對(duì)照品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上(條狀點(diǎn)樣),以三氯甲烷-甲醇-水(28 ∶10 ∶1,V/ V/ V)為展開劑,展開,取出,晾干。噴以5%三氯化鋁乙醇溶液,在105 ℃加熱數(shù)分鐘,置紫外光(365 nm)下檢視。色譜圖見圖2 C。可見,供試品溶液色譜中,在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對(duì)照無干擾。
2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱:Waters X select HSS T3 十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脫程序見表1;蒸發(fā)光散射檢測器,漂移管溫度:105 ℃,載氣流速:3.0 L/min。在此色譜條件下,各成分分離度良好,陰性對(duì)照無干擾,理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。色譜圖見圖3。
表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序(%)
圖5 含量測定高效液相色譜圖
2.2.2 溶液制備
取各對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL 含人參皂苷Rg10.08 mg、人參皂苷Re 0.13 mg、人參皂苷Rb10.20 mg 和黃芪甲苷0.07 mg 的混合溶液,即得對(duì)照品溶液。取本品約4 g,混勻,研細(xì),精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加水50 mL,超聲處理(功率為300 W,頻率為37 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量,離心10 min,取上清液25 mL,加乙醚振搖提取3 次,每次30 mL,棄去乙醚液,水液再用水飽和正丁醇提取5 次,每次25 mL,合并正丁醇提取液,用氨試液充分洗滌2 次,每次40 mL,合并氨試液,用水飽和正丁醇提取2 次,每次20 mL,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得供試品溶液。分別取缺人參陰性樣品、缺黃芪陰性樣品,按供試品溶液制備方法制備缺人參和缺黃芪陰性對(duì)照品溶液。
2.2.3 方法學(xué)考察
線性關(guān)系考察:配制線性關(guān)系考察樣品溶液6 份,進(jìn)樣10 μL,以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)(X,mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)繪制校正曲線。結(jié)果見表2。
表2 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果
重復(fù)性試驗(yàn):取樣品(批號(hào)為180608)6 份,精密稱定,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件測定。結(jié)果人參皂苷Rg1,Re,Rb1及黃芪甲苷含量的RSD 分別為1.75%,3.33%,2.88%,3.07%(n =6),表明方法重復(fù)性良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取樣品(批號(hào)為180608)4 g,精密稱定,依法制備供試品溶液,分別于0,4,8,12,16,20,24,28 h 時(shí)按擬訂色譜條件測定。結(jié)果人參皂苷Rg1,Re,Rb1及黃芪甲苷含量的RSD 分別為3.71% ,2.40% ,1.81%,1.73%(n =8),表明供試品溶液28 h 內(nèi)穩(wěn)定。
加樣回收試驗(yàn):取樣品(批號(hào)為180608)6 份,每份2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入混合對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度分別為0.414 55,1.007 46,1.504 21,0.538 47 mg/mL 的人參皂苷Rg1,Re,Rb1和黃芪甲苷)1 mL,揮干,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。
2.2.4 樣品含量測定
為確保含量數(shù)據(jù)更具有代表性,廣州康臣藥業(yè)有限公司增加樣品15 批,共18 批樣品,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,計(jì)算含量。結(jié)果見表4。按人參皂苷總量、黃芪甲苷含量平均值的80%設(shè)限,結(jié)果分別為1.08,0.26 mg /g。擬規(guī)定樣品中每1 g 含人參以人參皂苷Rg1(C42H72O14)、人參皂苷Re((C54H92O23)和人參皂苷Rb1(C54H92O23)的總量計(jì),不得少于1.08 mg;每1g 含黃芪以黃芪甲苷(C41H68O14)計(jì),不得少于0.26mg。
表3 各成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n =6)
表4 18 批樣品各成分含量測定結(jié)果(mg /g,n =18)
人參、黃芪:人參為新增項(xiàng),黃芪為修訂項(xiàng)。原標(biāo)準(zhǔn)黃芪鑒別采用萃取、洗滌后還需上大孔樹脂柱多溶劑洗脫,操作煩瑣,檢驗(yàn)周期太長,故對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化。人參、黃芪、三七等的皂苷鑒別常使用三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶7 ∶2,V/ V/ V)及三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10,V/ V/ V/ V)展開,難以將人參皂苷與黃芪甲苷較好地分離,且色譜條件受環(huán)境影響較大,需嚴(yán)格控制溫度和濕度,重復(fù)性相對(duì)較差[4]。根據(jù)相關(guān)經(jīng)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[5],選擇展開條件。
甘草:原標(biāo)準(zhǔn)以甘草酸銨對(duì)照品為對(duì)照,甘草陰性對(duì)照無干擾,但斑點(diǎn)信息較少,試驗(yàn)中曾噴以10%硫酸乙醇加熱顯色后再觀察[6],發(fā)現(xiàn)甘草陰性對(duì)照有干擾,故參考文獻(xiàn)[7]制訂展開條件。
黃連:原標(biāo)準(zhǔn)中需要二次展開,操作較復(fù)雜,且加入黃連對(duì)照藥材后,發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照有干擾,故參考文獻(xiàn)[7]選擇展開條件。
陳皮:修訂時(shí)增加了陳皮對(duì)照藥材,但在驗(yàn)證原標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí)發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照有干擾。參考2015 年版《中國藥典(一部)》女金丸項(xiàng)下的展開條件[8]521-522,修訂后的方法操作簡便,陳皮陰性對(duì)照無干擾,專屬性強(qiáng)。
獨(dú)活、白芍 獨(dú)活:TLC 原標(biāo)準(zhǔn)的提取方式耗時(shí)長,且斑點(diǎn)不清晰,常需加大點(diǎn)樣量,而采用2.1 項(xiàng)下乙醚液揮干后作為供試品溶液,既節(jié)省溶劑,減少樣品用量,且斑點(diǎn)又清晰,陰性對(duì)照無干擾,方法專屬性強(qiáng)。白芍在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了白芍對(duì)照藥材,陰性對(duì)照無干擾,方法專屬性強(qiáng)。
各TLC 鑒別均考察了青島海洋化工硅膠G 和Merck 硅膠G60 預(yù)制板2 種不同薄層板的層析效果,各成分的Rf值存在一定差異,但與相鄰成分分離度均良好,表明2 種薄層板均能滿足鑒別的要求。另固定薄層板,比較在不同溫濕度條件下展開的薄層效果,結(jié)果表明,溫度和相對(duì)濕度對(duì)薄層色譜效果無明顯影響。
人參的主要有效成分為總皂苷,5 種人參皂苷(Rb1,Rb2,Rg1,Rc,Re)占總皂苷含量的80%,具有延緩疲勞產(chǎn)生的作用,主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善機(jī)體功能、消除疲勞等方面[9]。黃芪的主要有效成分為黃芪甲苷,黃芪甲苷治療腎性高血壓大鼠時(shí),不僅降壓效果顯著,還可抑制腎氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解腎病理損傷[10]。人參、黃芪是益腎化濕顆粒的君藥,其現(xiàn)代藥理作用均與益腎化濕顆粒的功能主治密切相關(guān)。因此,對(duì)人參皂苷Rg1,Re,Rb1和黃芪甲苷進(jìn)行定量及定性分析,可更好地控制該制劑的質(zhì)量。
2015 年版《中國藥典(一部)》中人參含量測定項(xiàng)下人參皂苷的測定波長為203 nm[8]8-9;黃芪含量測定項(xiàng)下黃芪甲苷含量測定采用蒸發(fā)光散射檢測器法檢測[8]302-303。最初采用紫外光與蒸發(fā)光串聯(lián)同步測定,在研究過程中,發(fā)現(xiàn)樣品在203 nm 波長處人參分離度較差、陰性對(duì)照有干擾,且人參皂苷Rg1,Re,Rb1在蒸發(fā)光下響應(yīng)值也較高,而原標(biāo)準(zhǔn)中在測定人參中的人參皂苷Rb1時(shí)也采用蒸發(fā)光散射檢測器法,最終確定文中的色譜條件。