成榮，李紅凌，胡方芳，許強(qiáng),3，羅振華,3，李偉

1貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025；2 貴州省人民醫(yī)院；3 國家衛(wèi)生健康委員會(huì)肺臟免疫性疾病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

近平滑念珠菌是一種機(jī)會(huì)性真菌感染病原體，是第二或第三臨床常見的真菌感染病原體[1]。近平滑念珠菌的致病性與多個(gè)毒力因子的影響密切相關(guān)，如黏附于人體組織、器官和植入性的醫(yī)療器械，分泌各種裂解酶(蛋白酶，磷脂酶和溶血素)，可表型轉(zhuǎn)換，形成生物膜及逃避免疫系統(tǒng)攻擊等[2,3]，其中生物膜的形成被認(rèn)為是近平滑念珠菌一個(gè)重要的毒力因子。生物膜是由菌體在其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)包裹中形成的致密結(jié)構(gòu)，與病原體的耐藥性形成密切相關(guān)，生物膜相關(guān)感染性疾病的治療難度增大[4,5]。發(fā)達(dá)國家多種醫(yī)院感染性疾病的發(fā)生與生物膜形成有關(guān)，如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、鼻竇炎、尿路感染、慢性前列腺炎、牙周炎等[6,7]。因此，為有效防治與生物膜形成相關(guān)的感染性疾病，研發(fā)新的藥物具有重要意義?？咕木哂幸种粕锬ば?、破壞生物膜結(jié)構(gòu)及殺死生物膜內(nèi)細(xì)胞的能力?？咕膆LF 1-11是人源N-端乳鐵蛋白衍生肽，Roberta等[8]研究發(fā)現(xiàn)，hLF1 -11可通過顯著降低生物膜細(xì)胞密度和代謝活性，下調(diào)生物膜形成相關(guān)基因CpALS7、 CpACE2、 CpEFG1等的表達(dá)，抑制近平滑念珠菌生物膜的形成。MAF-1(Musca domestica antifungal peptide -1)是經(jīng)免疫誘導(dǎo)后從家蠅(Musca domestica)幼蟲血淋巴中分離得到的一個(gè)新型抗真菌肽[9]。MAF-1A是MAF-1碳端α螺旋功能結(jié)構(gòu)域第128-153位26個(gè)氨基酸肽段[10]。我們前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，MAF-1A對多種常見致病性念珠菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性。本研究通過體外培養(yǎng)形成近平滑念珠菌生物膜，觀察不同濃度MAF-1A對近平滑念珠菌生物膜形成及對生物膜細(xì)胞活性強(qiáng)弱的影響，了解MAF-1A對近平滑念珠菌的抗菌作用特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及儀器 近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC22019，近平滑念珠菌臨床株F1356、F983、F668由貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存?？拐婢腗AF-1A及其熒光標(biāo)記衍生肽FITC-MAF-1A均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，使用分析型高效液相色譜(HPLC)鑒定其純度>95%，行ESI質(zhì)譜檢測，確認(rèn)多肽序列正確。主要試劑：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)購于北京索萊寶科技有限公司，氟康唑(FLC)購于美國Sigma公司，細(xì)胞活性檢測試劑盒XTT Assay Kit (ab232856) 購于英國Abcam公司。

1.2 MAF-1A的體外抗真菌活性觀察

1.2.1 不同稀釋濃度SDB培養(yǎng)基的選擇 將經(jīng)SDA平板活化的ATCC22019菌體適量重懸于SDB、1/2SDB、1/4SDB、1/8SDB、1/16SDB、1/32SDB培養(yǎng)基中，每孔200 μL加入無菌96孔板中35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后檢測OD490nm值。SDB、1/2SDB、1/4SDB、1/8SDB、1/16SDB、1/32SDB培養(yǎng)基中ATCC22019的OD490nm分別為0.160±0.005、0.162±0.008、0.161±0.006、0.119±0.002、0.052±0.003、0.045±0.001，SDB、1/2SDB、1/4SDB培養(yǎng)基中ATCC22019的OD490nm組間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SDB、1/2SDB、1/4SDB濃度培養(yǎng)基未影響ATCC22019生長。

1.2.2 MAF-1A最低抑菌濃度(MIC)測定 參考臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)M27-A3測定MAF-1A的抗真菌活性。取活化的ATCC22019菌落重懸于SDB、1/2SDB、1/4SDB培養(yǎng)基中，濃度調(diào)至1～5×103CFU/mL。加入不同濃度MAF-1A(0.1、0.2、0.3 、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0 mg/mL)，無MAF-1A處理的菌懸液為生長對照，培養(yǎng)基為空白對照孔，另選擇0.1 mg/mL的FLC為藥物對照。經(jīng)35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定吸光度OD490nm值，最低抑菌濃度(MIC)值[12]：真菌生長百分率=(各孔OD490nm值-空白對照孔OD490nm 值)/(生長對照孔OD490nm值-空白對照孔OD490nm值)×100%；真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)=(1-真菌生長百分?jǐn)?shù))×100%。取真菌生長抑制百分?jǐn)?shù)≥80%的最低藥物濃度為MIC值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1/4SDB培養(yǎng)基中MAF-1A能更好的發(fā)揮抗ATCC22019菌活性，其MIC值為0.3 mg/mL。

1.3 不同濃度MAF-1A對近平滑念珠菌生物膜形成的影響觀察

1.3.1 生物膜形成菌株選擇 取-80 ℃保存的F668、F983、F1356、ATCC22019接種于SDA平板上，35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h復(fù)蘇菌株，挑取直徑>5 mm的單菌落于1/4SDB中混勻?yàn)榫鷳乙?，調(diào)整濃度2×106CFU/mL，100 μL/孔加入到取聚苯乙烯無菌96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌PBS緩沖液(PH=7.2～7.4)清洗3遍將未附著的菌體洗下并檢測OD490nm值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)如下判定方法判定菌株生物膜形成能力[13]：OD490nm<0.03，無生物膜形成能力；0.03≤OD490nm<0.08，生物膜形成能力弱；0.08≤OD490nm<0.16生物膜形成能力一般；OD490nm>0.16，生物膜形成能力強(qiáng)[13]。F668、F983、F1356、ATCC2201的OD490nm分別為0.002±0、0.032±0.02、0.133±0.007、0.004±0.004，F(xiàn)1356具有體外生物膜形成能力，F(xiàn)668、F983、ATCC2201均無體外生物膜形成能力。鏡下可見體外培養(yǎng)時(shí)，F(xiàn)1356形成的生物膜菌體密度高且連接緊密，形成較致密的結(jié)構(gòu)。因此本研究后續(xù)以該菌所形成的生物膜進(jìn)行有關(guān)近平滑念珠菌生物膜相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 不同濃度MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力檢測 取F1356菌體適量于1/4SDB中，調(diào)整菌液濃度為2×106CFU/mL，100 μL/孔加入到無菌聚苯乙烯96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，PBS清洗3遍，將F1356分為5份，每份3個(gè)復(fù)孔，其中四份分別加入100 μL濃度為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A 使其，加入無菌水者為空白對照。另將F1356分為5份，每份3個(gè)復(fù)孔，其中4份分別加入0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC，加入無菌水者為空白對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，PBS清洗3遍，Synergy H1微孔板檢測儀檢測OD490nm值，以O(shè)D490nm值代表MAF-1A、FLC處理的F1356生物膜形成能力。重復(fù)3次，取平均值。并于倒置顯微鏡下觀察F1356生物膜中的菌體密度及膜致密結(jié)構(gòu)。

1.3.3 MAF-1A與F1356生物膜結(jié)合情況觀察 采用熒光標(biāo)記技術(shù)。體外培養(yǎng)F1356使其形成生物膜，培養(yǎng)方法同“1.3.1”。在培養(yǎng)液中加入0.6 mg/mL的 FITC-MAF-1A培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、3、6、12、24 h時(shí)取共培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下(藍(lán)光激發(fā))觀察MAF-1A與F1356生物膜的結(jié)合情況。熒光標(biāo)記的衍生肽FITC-MAF-1A可與F1356生物膜結(jié)合并進(jìn)入生物膜內(nèi)，鏡下可觀察到黃綠色熒光信號。

1.3.3 不同濃度 MAF-1A處理的F1356生物膜細(xì)胞活性強(qiáng)弱檢測 采用XTT細(xì)胞活性檢測技術(shù)。將F1356菌體分為5份，每份3個(gè)復(fù)孔，其中4份分別加入100 μL濃度為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A 使其，加入無菌水者為空白對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，PBS清洗3遍，按照XTT Assay Kit (ab232856) 試劑盒操作說明檢測F1356生物膜內(nèi)細(xì)胞活性。Synergy H1微孔板檢測儀檢測OD450nm值，以O(shè)D450nm代表F1356生物膜的細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)中全程閉光操作。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力比較 0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力分別為0.156±0.011、0.071±0.007、0.025±0.003、0.007±0.002，空白對照孔為0.163±0.009，與空白對照比較，0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05)。0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜形成能力分別為0.144±0.008、0.073±0.007、0.023±0.005、0.004±0.002，空白對照孔為0.144±0.008，與空白對照比較，0.6、0.9、1.2 mg/mL的 FLC處理后F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05)。

鏡下可見與對照組相比，0.6、0.9、1.2 mg/mL的MAF-1A處理的F1356生物膜中菌體密度減少，膜致密結(jié)構(gòu)被破壞；與對照組相比，0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC處理的F1356生物膜中菌體密度減少，膜致密結(jié)構(gòu)被破壞。見圖1。

注：A, F為空白對照；B為0.3 mg/mL MAF-1A 處理的F1356；C為0.6 mg/mL MAF-1A 處理的F1356；D為0.9 mg/mL MAF-1A處理的F1356；E為1.2 mg/mL MAF-1A 處理的F1356；G為0.3 mg/mL FLC 處理的F1356；H為0.6 mg/mL FLC 處理的F1356；I為 0.9 mg/mL FLC 處理的F1356；J為 1.2 mg/mL FLC 處理的F1356。

2.2 MAF-1A與F1356生物膜的結(jié)合情況 隨培養(yǎng)時(shí)間延長，鏡下可見黃綠色熒光信號逐漸增多，培養(yǎng)24 h時(shí)可觀察到生物膜內(nèi)存在大量黃綠色熒光信號。見圖2。

圖2 培養(yǎng)1、3、6、12、24 h MAF-1A與近平滑念珠生物膜的結(jié)合情況

2.3 不同濃度MAF-1A處理的F1356生物膜細(xì)胞活性比較 0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL MAF-1A處理的F1356生物膜活性分別為0.873±0.031、0.655±0.029、0.535±0.038、0.471±0.017，空白對照孔為1.268±0.167，隨MAF-1A濃度增加，F(xiàn)1356生物膜細(xì)胞活性逐漸降低(P均≤0.05)。0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜活性分別為0.841±0.061、0.845±0.050、0.894±0.036、0.982±0.056，空白對照孔為1.368±0.144，與對照組比較，0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜活性降低(P均≤0.05)，與0.3 mg/mL FLC比較，0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜活性升高(P均≤0.05)。

3 討論

近平滑念珠菌的感染率增加與其易黏附于固體材料表面及易在導(dǎo)管等醫(yī)用材料上形成生物膜密切相關(guān)[14]，生物膜形成后對常用抗真菌藥物敏感性大大降低[15]。我們發(fā)現(xiàn)，MAF-1A在0.6 mg/mL濃度下即可抑制近平滑念珠菌生物膜的形成。隨藥物劑量及作用時(shí)間的增加，MAF-1A抑制近平滑念珠菌生物膜形成作用增強(qiáng)，提示MAF-1A對生物膜形成具有較好的抑制作用，其作為抗生物膜藥物開發(fā)資源具有重要研究價(jià)值。

目前生物膜的耐藥性機(jī)制尚不明確。有研究[16]報(bào)道，近平滑念珠菌生物膜內(nèi)菌體生長結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，菌絲相的菌體所占比例增加，同時(shí)，生物膜內(nèi)細(xì)胞代謝較游離狀態(tài)的細(xì)胞增加，這些變化可能有利于其對抗真菌藥物產(chǎn)生耐受。關(guān)于生物膜的耐藥機(jī)制研究中，抗菌藥物的滲透障礙被認(rèn)為是生物膜耐藥性產(chǎn)生的主要原因之一[17]。研究[18,19]發(fā)現(xiàn)，抗菌藥物不能有效的結(jié)合并進(jìn)入膜內(nèi)，從而使抗菌藥物作用效果減弱。相較于游離狀態(tài)的菌體，生物膜菌體連接緊密，密度高，尤其是生物膜形成的特殊細(xì)胞外基質(zhì)，主要成分為水不溶性的胞外多糖，極大阻礙了抗菌藥物進(jìn)入生物膜發(fā)揮抗菌效應(yīng)。我們通過固相合成抗真菌肽MAF-1A的熒光標(biāo)記衍生肽(FITC-MAF-1A)，并將FITC-MAF-1A與F1356生物膜共同孵育不同時(shí)間后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間的延長，越來越多的MAF-1A結(jié)合于F1356生物膜，并在膜內(nèi)聚集，這提示我們，MAF-1A與F1356生物膜具有較好親和性，能透過生物膜進(jìn)入膜內(nèi)。我們推測，這可能與抗菌肽本質(zhì)為蛋白質(zhì)，與生物膜的親和性較其他類型的藥物要高，這是其可應(yīng)用于抗生物膜藥物研發(fā)資源的一大優(yōu)勢。有研究報(bào)道，生物膜細(xì)胞活性增加，代謝活性增強(qiáng)，使得生物膜對抗菌藥物的適應(yīng)性，代謝等能力增強(qiáng)。這可能是導(dǎo)致生物膜耐藥性較高的原因之一。在我們的研究中，MAF-1A作用下F1356生物膜細(xì)胞活性降低，隨著多肽濃度的增加細(xì)胞活性逐漸降低。結(jié)合熒光顯微鏡觀察結(jié)果，MAF-1A可結(jié)合并逐漸聚集于生物膜細(xì)胞內(nèi)，推測隨著作用時(shí)間延長，進(jìn)入生物膜細(xì)胞內(nèi)MAF-1A通過破壞細(xì)胞膜、胞內(nèi)細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，紊亂細(xì)胞正常的代謝反應(yīng)，從而影響細(xì)胞活力。MAF-1A具有較好的抗生物膜特性，可作為抗生物膜藥物研發(fā)對象。

綜上所述，MAF-1A可抑制F1356的生物膜形成，且MAF-1A可與F1356生物膜結(jié)合進(jìn)入生物膜內(nèi)，抑制F1356生物膜的細(xì)胞活性，可作為抗生物膜藥物研發(fā)對象，值得我們進(jìn)行更為深入的研究。