松郁安神方對(duì)肝郁證失眠大鼠機(jī)體褪黑素水平的影響

張一帆 李星 張瑜

摘要 目的：觀察松郁安神方對(duì)肝郁證失眠大鼠機(jī)體褪黑素水平的影響。方法：將40只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組及松郁安神方低、中、高劑量組，采用慢性?shī)A尾刺激和腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）復(fù)合因子造模法建立肝郁證失眠大鼠模型，給藥后測(cè)定肝郁證失眠大鼠機(jī)體的腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）褪黑素（MT）水平的變化。結(jié)果：肝郁證失眠大鼠機(jī)體腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）的MT水平均顯著低于正常組（P<0.05），松郁安神方低劑量組腦脊液、血清、海馬的MT水平及松郁安神方中劑量組血清的MT水平顯著高于模型組（P<0.05），而松郁安神方低劑量組血清的MT水平與松郁安神方中劑量組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)論：松郁安神方對(duì)肝郁證失眠大鼠具有促睡眠作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)提高機(jī)體褪黑素水平而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 松郁安神方;失眠;肝郁證;褪黑素

Abstract Objective：To observe the effect of Song Yu An Shen Fang on levels of melatonin in rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi.Methods：A total of 40 rats were randomly divided into normal control group，model group，low，medium and high dose group of Song Yu An Shen Fang group.The insomnia rat model of liver depression syndrome was established by chronic tail clamping stimulation and intraperitoneal injection of PCPA compound factor.The changes of melatonin（MT）in cerebrospinal fluid，serum and brain tissue（hypothalamus and hippocampus）of insomnia rats with stagnation of liver qi syndrome were measured after administration.Results：The MT level of cerebrospinal fluid，serum and brain tissue（hypothalamus and hippocampus）in the insomnia rats with stagnation of liver qi syndrome was significantly lower than that in the normal group（P<0.05）.The MT levels of CSF，serum and hippocampus in the low dose group and the middle dose group were significantly higher than those in the model group（P<0.05）.There was no significant difference in MT level between the low dose group and the middle dose group（P>0.05），Conclusion：The effect of Song Yu An Shen Fang on promoting sleep of insomnia with syndrome of stagnation of liver qi may be achieved by increasing the level of melatonin.

Keywords Song Yu An Shen Fang; Insomnia; Syndrome of stagnation of liver qi; Melatonin

中圖分類號(hào)：R256.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2020.03.074

中醫(yī)在治療失眠上有獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，其病因病機(jī)雖復(fù)雜，但其發(fā)病與個(gè)體的體質(zhì)和性格特征密切相關(guān)，臨床上多數(shù)失眠的反復(fù)發(fā)作與異常情緒常相互伴隨，并且一些針對(duì)失眠的證型和方藥研究[1，2]顯示從肝郁論治失眠具有較好療效。

黃俊山教授結(jié)合多年失眠的臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)制了松郁安神方（藥用：甘松、郁金、玫瑰花、生龍骨、珍珠母、夜交藤、丹參、酸棗仁）主要針對(duì)肝郁證而設(shè)，功在疏肝解郁、安神定志，經(jīng)臨床證實(shí)療效確切，但作用機(jī)制需要進(jìn)一步明確。本文通過(guò)觀察松郁安神方對(duì)肝郁證失眠大鼠在腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）中褪黑素（MT）水平的變化，探討松郁安神方影響睡眠的藥效作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[動(dòng)物合格證編號(hào)：20170005009597，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005]。將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、松郁安神方低劑量組、松郁安神方中劑量組、松郁安神方高劑量組，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物的制備 松郁安神方的組成及用量：成人（按60 kg體質(zhì)量計(jì)算）用量：甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，生龍骨（先煎）30 g，珍珠母（先煎）30 g，合歡皮15 g，丹參15 g，酸棗仁15 g，所有中藥均購(gòu)于福州鷺燕醫(yī)藥有限公司;大鼠用量為成人的6倍（按體質(zhì)量計(jì)算），按傳統(tǒng)煎藥方法煎煮，濃縮，分裝滅菌后4 ℃冰箱冷藏備用;臨用前置于室溫環(huán)境下預(yù)熱（其中最終含生藥濃度低劑量為0.7 g/mL、中劑量為1.4 g/mL、高劑量為2.8 g/mL）。

對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）的配制：將PCPA充分研磨，用弱堿性生理鹽水助溶，臨用時(shí)配成40 mg/mL的混懸液。

1.3 造模及干預(yù)方法 采用朱潔等[3]肝郁證失眠大鼠模型的建造方法，給予大鼠慢性?shī)A尾刺激和PCPA腹腔注射復(fù)合因子造模法，將每組大鼠置于同一籠內(nèi)，用尖端包扎紗布的止血鉗分別夾大鼠尾部，令其與其他大鼠廝打，每天刺激40 min，控制刺激強(qiáng)度，以不破皮流血為度，連續(xù)20 d，于造模第16天起，模型組和松郁安神方低劑量組、中劑量組、高劑量組的大鼠按40 mg/100 g腹腔注射PCPA，1次/d，連續(xù)2 d;于造模第7天起，正常對(duì)照組、模型組給予生理鹽水及松郁安神方各組大鼠給藥以1 mL/（100 g·d）灌胃，連續(xù)14 d;造模第21 d，用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g體質(zhì)量麻醉大鼠，以備實(shí)驗(yàn)取材。

1.4 標(biāo)本取材 實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后，頭部剪毛與消毒后，剪開頭部皮膚，成十字口，從蛛網(wǎng)膜下腔進(jìn)針，取腦脊液，離心，取上清液，置于-70 ℃保存?zhèn)溆?取完腦脊液后，腹主動(dòng)脈取血，靜置兩小時(shí)，離心，取上清液，分裝離心管，置于-70 ℃保存?zhèn)溆?取血后大鼠斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側(cè)視神經(jīng)后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個(gè)腦組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，冰上分離出下丘腦和海馬組織，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠血清、腦脊液、腦組織（海馬、下丘腦）的褪黑素（MT）的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS statistics V21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，若方差齊采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 正常對(duì)照組，精神狀態(tài)好、反應(yīng)靈敏、毛發(fā)有光澤;模型組和松郁安神方各組，在第1w內(nèi)，大鼠表現(xiàn)為易激惹、防御、抵抗和互相撕咬、尖叫明顯、反應(yīng)靈活、毛發(fā)欠光澤、飲食減少;在后2w內(nèi)，模型組大鼠神情倦怠、易激惹、各種防御、抵抗和互相撕咬不及之前積極、尖叫聲細(xì)、反應(yīng)欠靈活、毛發(fā)干枯、有脫毛現(xiàn)象，符合肝郁證失眠模型的體征表現(xiàn)[3]，松郁安神方各組較模型組一般狀態(tài)均有改善。

2.2 各組大鼠腦脊液、血清、腦組織MT含量比較及均值圖 結(jié)果顯示，肝郁證失眠大鼠機(jī)體腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）的MT水平均顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;松郁安神方低劑量組腦脊液、血清、海馬的MT水平及松郁安神方中劑量組血清的MT水平顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而松郁安神方低劑量組血清的MT水平與松郁安神方中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。從表1、2的比較和圖1均值圖可知，劑量越大對(duì)肝郁證失眠機(jī)體褪黑素水平的影響越小。見表1、表2與圖1。

3 討論

隨著現(xiàn)代社會(huì)的壓力越來(lái)越大，情志不舒導(dǎo)致失眠占的比重日益居多，肝性喜調(diào)達(dá)惡抑郁，從肝郁論治不寐自古有之，如《辨證錄·不寐門》說(shuō)：“氣郁既久，則肝氣不舒，肝氣不舒，則肝血必耗，肝血既耗，則木中之血上不能潤(rùn)于心”則不寐。施明等[4]認(rèn)為五臟雖皆有不寐之象，但其根源不離于肝，精神情志因素是重要環(huán)節(jié)，故指出臨床辨證用藥當(dāng)從肝論治，以治肝為中心，兼顧調(diào)理其他四臟。肝郁影響肝藏血的生理功能，李世金[5]認(rèn)為睡眠的晝夜節(jié)律與肝的關(guān)系密切，睡眠有明顯的生物節(jié)律性，睡眠生物節(jié)律性的調(diào)控，是通過(guò)肝藏血來(lái)完成的。

褪黑素（Melatonin，MT）：是在哺乳動(dòng)物及人體松果體中分泌的主要激素，MT調(diào)節(jié)人體免疫功能、衰老等過(guò)程，褪黑素在預(yù)防皮層功能紊亂，如運(yùn)動(dòng)、感覺、記憶和心理?yè)p傷方面是非常有用的[6]。在褪黑素多方面調(diào)節(jié)作用中，對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)作用顯得尤為突出，其分泌呈夜高晝低的規(guī)律，夜間褪黑素水平的高低直接影響睡眠的質(zhì)量;據(jù)報(bào)道[7]褪黑素對(duì)中樞神經(jīng)興奮性的抑制機(jī)制可能通過(guò)抑制一氧化氮合酶，使谷氨酸受體激活產(chǎn)生NO水平下降而起作用。說(shuō)明MT抑制NO及MDA的升高作用，即抗自由基和抗過(guò)氧化損傷作用，可能是其發(fā)揮改善睡眠剝奪大鼠行為障礙的重要作用機(jī)制之一。腦內(nèi)促睡眠系統(tǒng)主要包括下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)、大腦皮質(zhì)等結(jié)構(gòu)的GABA能神經(jīng)元及相關(guān)遞質(zhì)，下丘腦視交叉上核可能是控制晝夜節(jié)律的關(guān)鍵部位;海馬在睡眠的調(diào)節(jié)中同樣起重要作用，可促進(jìn)慢波睡眠，因此海馬是研究睡眠一個(gè)很有意義的觀察點(diǎn)[8]。大鼠的生活規(guī)律晝伏夜出，完全符合我們?nèi)臻g取材探討褪黑素影響睡眠的節(jié)律，因此我們選擇MT作為觀察指標(biāo)，并選取了腦脊液、血清、下丘腦、海馬多部位的檢測(cè)。

肝郁證失眠和MT有一定的相關(guān)性，王志丹[9]通過(guò)失眠癥中醫(yī)證素分布規(guī)律及其與相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、激素的關(guān)聯(lián)性研究提示中醫(yī)的病位證素肝與MT具有相關(guān)性，對(duì)失眠癥的干預(yù)可從調(diào)肝入手。王興凱[10]研究表明慢性應(yīng)激肝郁證與MT之間存在明確的相關(guān)性。

基于中醫(yī)特色，目前從肝郁證論治失眠的自擬方，如黃娜娜等[11]用自擬的清肝安神湯及張麗[12]用自擬的疏肝解郁湯治療肝郁證失眠，療效明顯;松郁安神方是福建省名老中醫(yī)黃俊山教授根據(jù)多年失眠臨證經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的針對(duì)肝郁證失眠的有效方劑，功用疏肝解郁，安神定志，該方重用甘松、郁金、玫瑰花疏肝解郁、調(diào)暢氣血為君，甘松現(xiàn)代藥理研究證實(shí)既抗焦慮又抗抑郁，改善情緒[13];生龍骨和珍珠母重鎮(zhèn)安神為臣，以解除肝郁氣滯，郁而化火，沖擾心神，心神不能鎮(zhèn)懾;佐以酸棗仁養(yǎng)心安神、合歡皮解郁安神、丹參寧心安神，以緩解氣郁化火，日久傷陰，陰虛火旺，沖擾肝魂，擾犯心經(jīng);該方重在疏肝解郁，兼顧重鎮(zhèn)安神和寧心安神，臨床療效確切，其藥效學(xué)機(jī)制需進(jìn)一步闡明。

本研究結(jié)果顯示：肝郁證失眠大鼠機(jī)體腦脊液、血清、腦組織（下丘腦、海馬）的MT水平均顯著低于正常組（P<0.05），驗(yàn)證了肝郁證失眠和MT的相關(guān)性;松郁安神方低劑量組腦脊液、血清、海馬的MT水平及松郁安神方中劑量組血清的MT水平顯著高于模型組（P<0.05），而松郁安神方低劑量組血清的MT水平與松郁安神方中劑量組比較無(wú)顯著差異（P>0.05），提示松郁安神方低、中劑量組對(duì)肝郁證失眠機(jī)體褪黑素水平有不同程度的提高，對(duì)睡眠有一定的促進(jìn)作用，松郁安神方的藥效機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)褪黑素水平來(lái)調(diào)整睡眠。

從表1、表2的比較和圖1均值圖可知，劑量越大對(duì)肝郁證失眠機(jī)體褪黑素水平的影響越小;這與臨床用藥中，不是一味用大劑量，完全符合;考慮其原因是否劑量增加到一定程度，由促進(jìn)褪黑素分泌到抑制其分泌，或有可能影響到其他神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)拮抗。方劑的藥效學(xué)機(jī)制都是多方面、多靶點(diǎn)的，松郁安神方的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討，以期更好的為臨床服務(wù)。

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