鄭 洋，王嘉孺，劉露露，王佳慧，趙鐵建

1 廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院醫(yī)學系，南寧 530021；2 廣東醫(yī)科大學護理學院，廣東 東莞 523000；3 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院教學部，南寧 530022；4 廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 生理教研室，南寧 530021

肝纖維化是慢性或反復性肝損傷的最終共同途徑，以細胞外基質(ECM)蛋白主要是膠原蛋白的過度積累為特征。晚期慢性纖維化常發(fā)展成為肝硬化，且伴有結構喪失和功能衰竭的并發(fā)癥發(fā)生[1-3]。肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)構成了肝血竇的血管壁, 是肝內非實質細胞的主要類型。已分化的LSEC電鏡下有其特征性的窗孔結構, 且窗孔內皮下缺乏完整的基膜，這種特征性結構在肝實質細胞與血液物質交換中起著關鍵作用[4]。在肝纖維化發(fā)生早期，LSEC就會出現去窗孔化，內皮下基底膜形成，這種現象被稱為肝竇毛細血管化，是肝纖維化形成的一個重要病理學改變[5-7]。

豬通常被稱作“六畜之首”。考古學家發(fā)現，早在近萬年前，人類就開始馴化并飼養(yǎng)野豬了。野豬性格兇猛，發(fā)起怒來連“獸中之王”老虎也要怕它三分。而被馴化的家豬，不但一改野豬的習性，而且在外貌上也發(fā)生了很大的變化。豬渾身都是寶，不僅是重要的肉食來源，還是制作皮革的原料，就連糞便也是上等的農肥呢。

莪木醇為廣西道地藥材莪術的主要活性成分，具有抗纖維化作用，但具體作用機制仍不清楚。

Toll樣受體(TLR)是一類天然免疫受體，能引發(fā)一系列信號轉導，導致炎性介質的釋放，在天然免疫防御中起重要作用。其中TLR4是人類發(fā)現的第一個TLR相關蛋白，革蘭陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖(LPS)是其主要配體[8]。近年研究[9]發(fā)現，TLR4表達于各類肝臟細胞中，可以調節(jié)肝臟細胞的天然免疫反應，在肝臟疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。LPS/TLR4信號通路在肝星狀細胞(HSC)和LSEC活化可以促進肝纖維化的形成[10]，通過TLR4/MyD88/NF-κB、MARK兩條重要的信號通路直接增強肝臟的炎癥反應，影響HSC和LSEC等自身細胞活化、增殖、凋亡、膠原的分泌合成及促纖維化細胞因子分泌，促進肝纖維化形成。TLR4信號通路上的NF-κB是增強肝臟炎癥反應、參與調控LSEC增殖和凋亡、促進膠原合成及分泌的一個重要炎癥轉錄因子，可觸發(fā)炎性細胞因子大量釋放，如IL-6、TNFα、IL-8等[11]，增強肝臟的炎癥反應形成“炎性瀑布”，最終導致肝纖維化形成。本研究以LSEC的TLR4/NF-κB信號通路為研究對象，通過免疫印跡和實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測該信號通路上關鍵分子TLR4和NF-κB的表達水平，利用免疫熒光檢測NF-κB的表達及入核情況。

1 材料與方法

1.1 材料

治療后，平衡針灸治療組患者的生活質量評分為（78.12±8.12）分，常規(guī)針灸治療組患者的生活質量評分為（65.12±7.56）分，組間數據比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

1.1.2 藥物與試劑 莪術醇(阿拉丁C114054-20 mg)、HE試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，G1120)、Msson試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，G1340)、LPS(Sigma L2880)、小鼠抗大鼠TLR4一抗(Santa Cruz，J1016)、兔多抗P65(65 kD)(武漢三鷹生物技術有限公司，10745-1-AP)、兔單抗P-P65(65 kD)(CST，3033)、DAPI(碧云天，C1002)。

植物基質沙墊是江蘇綠東坡環(huán)境工程有限公司生產的一種采用高密度、耐用、防腐蝕特殊性聚酯纖維和特殊工藝編織成的雙層或多層編織物，現場鋪設在受保護的坡面上，按順序注入各種混合基質，使坡面受到保護，并可迅速恢復原有植被，達到自然狀態(tài)。植物基質沙墊無骨料，無鋼筋，水上水下整體施工，無需圍堰和船舶拖排，施工簡易，安全可靠，整體性強，防護性好，抗沖刷（5～6m/s），抗水壓（30t/m2）、防淘蝕，適用性強，生態(tài)美觀。植物基質沙墊根據各種工況要求，可設計成反濾型、無濾型、植草型、抗浪型等多種類型，可廣泛應用于堤岸防護、水資源保護和水土保持工程中。

1.1.3 主要儀器 低速離心機(Eppendorf，5702R)、水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1)、組織切片機(美國WPI公司，NVSLM1)、RT-PCR儀(ABI QuantStudio 6)、PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，EDC-810)。

據表1所示，從調查覆蓋的地理區(qū)域來說，本調查所收集到的招聘信息涵蓋了全國大部分?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)），獲得的招聘信息是比較充分的。

2.2 TLR4和NF-κB mRNA表達水平 各組間TLR4 mRNA和NF-κB mRNA比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)。與陽性對照組比較，莪術醇干預組和PDTC組TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達水平均明顯降低(P值均<0.05)。莪術醇干預組和PDTC組TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表3)。

1.2.3 RT-PCR法檢測TLR4和NF-κB mRNA 在細胞中加入1 ml Trizol試劑，用槍吹打混勻，移至無RNase的1.5 ml EP管中，裂解10 min，加入200 μl氯仿，劇烈顛倒混勻數次，室溫放置5 min，4 ℃以14 256×g離心15 min。轉移上層水相(約400 μl)于另一新1.5 ml EP管中，加入400 μl異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4 ℃以14 256×g離心10 min可見RNA沉淀。棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 ml，渦旋混勻后，4 ℃以9900×g離心5 min。棄上清，干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μl DEPC水中。在cDNA反應體系中將RNA轉錄成cDNA，反應條件為25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，將得到的cDNA放入RT-PCR反應體系中，反應條件為50 ℃ 2 min，95℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。取PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)上成相，利用分析系統(tǒng)進行灰度掃描，得到光密度值(IOD)，以GAPDH為內對照，TLR4和P65NF-κB上下游引物及長度見表1。

1.2.4 免疫印跡檢測TLR4和NF-κB 提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜。用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。用封閉液稀釋相應的一抗，用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃搖床孵育2 h。洗去多余的二抗，通過ECL顯色系統(tǒng)顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

1.1.1 實驗動物 清潔級KM小鼠50只，周齡2周，體質量12～16 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號[SCXK(湘)2016-0002]，使用許可證號[SYXK(桂)2015-0001]。所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

表1 引物序列表

2.3 TLR4和NF-κB蛋白的表達水平 各組間TLR4和NF-κB比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)。莪術醇干預組TLR4表達水平明顯低于陽性對照組和PDTC組(P值均<0.05)；莪術醇干預組和PDTC組磷酸化NF-κB表達水平明顯低于陽性對照組(P值均<0.05)(圖2，表4)。

1.3 動物倫理學審查 本研究方案經由廣西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 方法

1.2.1 動物和細胞實驗分組 50只小鼠按隨機數字表隨機分為3組：模型組(n=19)、莪術醇組(n=21)和空白組(n=10)，除去建模過程中死亡的小鼠，最后每組各10只。模型組和莪術醇組給予40%CCl4花生油混合液(劑量2 μl/g)，腹腔注射，每周2次，連續(xù)8周，空白組給予等量的花生油。在造模結束后，莪術醇組給予30 mg/kg莪術醇灌胃處理，給藥容積為1 ml/100 g，其余2組給予等量的生理鹽水。細胞共分為4組，取處于對數生長期，生長狀態(tài)良好的原代大鼠LSEC，用內皮細胞完全培養(yǎng)基調整細胞密度到5×104個/ml，接種96孔板，每孔100 μl細胞懸液，同時設空白孔，37 ℃培養(yǎng)過夜(在細胞孔周圍孔內加入100 μl無菌PBS)。2%DMEM培養(yǎng)基處理空白對照組；LPS陽性對照組用5 μg/ml LPS處理3 h；莪術醇干預組用45 μg/ml莪術醇預處理30 min后再用5 μg/ml LPS處理3 h；PDTC(NF-κB特異性抑制劑)組用25 μg/ml PDTC預處理30 min后再用5 μg/ml LPS處理3 h，每組設3個復孔。

2 結果

2.1 肝組織病理檢查結果 各組小鼠肝組織HE染色結果(圖1)顯示，空白組：肝細胞以匯管區(qū)為中心呈現放射狀排列，未見明顯異常病理學改變，肝竇清晰；模型組：肝小葉之間分界不清，存在假小葉，肝細胞排列不規(guī)則，有空泡樣的改變，大量膠原組織產生；莪術醇組：病變情況較模型組有所改善。Masson染色結果(圖1)顯示，空白組：肝組織內有少量膠原沉積；模型組：有大量膠原纖維沉積在肝小葉和肝竇內；莪術醇組：肝組織內膠原沉積較模型組改善。

依據肝纖維化病理Ishak評分標準[13]對HE圖片進行分析，正常為0分；匯管區(qū)有纖維化為1分；匯管區(qū)有纖維間隔形成為2分；匯管區(qū)大面積纖維化為3分；匯管區(qū)有纖維化伴明顯的匯管-中央橋接纖維化為4分；明顯的匯管-中央橋接纖維化伴有結節(jié)為5分；有肝硬化形成為6分。模型組Ishak評分顯著高于空白組(P<0.05)，莪術醇組Ishak評分顯著低于模型組(P<0.05)；模型組膠原表達水平顯著高于空白組(P<0.05)，莪術醇組膠原表達顯著低于模型組(P<0.05)(表2)。

1.2.2 LSEC分離培養(yǎng) LSEC的分離參照文獻[12]，采用肝臟膠原酶灌注結合Percoll密度梯度沉降法及細胞選擇性貼壁法。將Percoll密度梯度離心分離所得的LSEC，放到適宜的培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，飽和濕度，5%CO2中培養(yǎng)。細胞生長成鋪路石樣形態(tài)，待細胞生長達約80%融合度時，用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA)消化收集細胞。

表2 各組Ishak評分以及膠原表達情況

表3 TLR4和NF-κB基因mRNA表達情況

1.2.5 免疫熒光檢測NF-κB表達及入核情況 每組細胞用PBS洗3次，每次3 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS洗滌細胞3次。用含山羊血清的0.5%Triton X-100孵育細胞，與熒光標記羊抗兔IgG抗體共同孵育。使用熒光倒置顯微鏡進行可視化。

2.4 莪術醇可以減少NF-κB入核及表達 陽性對照組較空白對照組NF-κB表達水平增加，莪術醇干預組較陽性對照組表達水平有所下降，PDTC組較陽性對照組表達水平下降(圖3)。

本文通過對小說女主人公安娜·卡列尼娜分析和把握，分別從這一人物的正面形象和負面形象出發(fā)，力圖能夠展現出一個鮮活飽滿的魅力女性形象，但不得不承認的一點是，安娜形象的分析并不僅僅是局限于以上的幾點內容，而應該是更加豐富的、更加復雜的。作為一個男性作家托爾斯泰以他獨特的視角和細膩的筆觸，將自己獨特的女性觀融入小說創(chuàng)作，塑造了安娜·卡列尼娜這樣一個復雜而迷人的女性形象。

3 討論

肝纖維化是慢性肝炎進一步發(fā)展的重要階段，是ECM大量沉積的一種病理生理過程[14]。眾所周知，肝纖維化最終會導致肝硬化和肝衰竭。研究[15]表明肝纖維化可以被逆轉。筆者早期研究[16]表明，莪術醇具有抗纖維化作用?，F有數據表明，莪術醇可以恢復肝竇毛細血管化。LSEC構成了肝血竇的血管壁，是肝內非實質細胞的主要群體，約占肝非實質細胞的50%。已分化的LSEC電鏡下可見其特征性的窗孔結構，且窗孔內皮下缺乏完整的基膜，窗孔占據總表面積的6%～8%，這種多孔性結構在肝實質細胞與血液物質交換中起著關鍵作用[17-18]。肝纖維化或體外培養(yǎng)的LSEC功能及形態(tài)發(fā)生重要改變，一是LSEC的失窗孔化，表現為窗孔數目的減少和孔徑變小，甚至消失；二是肝竇內皮下形成高密度基底膜，這一現象于1963年由Schaffner等[19]發(fā)現并命名為肝竇毛細血管化。LSEC的失窗孔導致其通透性降低，各種代謝產物不容易進入血循環(huán)，加重肝病理性損傷；同時減弱了肝細胞和血液之間氧及營養(yǎng)物質的交換，最終導致肝細胞損傷和肝竇塌陷，而肝竇的塌陷會導致肝內血管網減少，在門靜脈高壓的形成過程中起重要作用[20-21]。

表4 TLR4和NF-κB蛋白表達水平

LSEC不僅是構成肝竇壁的主要成分，并且可以合成和分泌NO，調節(jié)肝內血管舒張和收縮，對肝竇血流的調節(jié)起重要作用。NO具有強大的血管擴張作用，它以旁分泌形式直接刺激可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)鳥苷酸增多，從而引起Ca2+降低和血管擴張。NO還可以通過抑制HSC中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)引起HSC舒張[22-23]。eNOS-NO-cGMP 信號通路是調控LSEC窗孔形成的重要通路[24]。當NF-κB信號通路活化時，IκB激酶被激活，使其磷酸化進而泛素化降解NF-κB抑制蛋白IκBα，胞質中IκBα水平下降，使NF-κB P65亞基從抑制狀態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)入核，P65的入核能激活多種炎癥因子的表達，同時能調節(jié)iNOS基因的轉錄，導致肝臟微循環(huán)的紊亂[25-26]。TLR4/NF-κB信號通路是調控機體炎癥反應的經典通路之一，TLR4是LPS的主要受體，參與了LPS誘導的炎癥反應和氧化損傷[27]。目前研究[28-29]表明, TLR4介導的NF-κB信號通路在肝纖維化的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用, HSC在靜止和活化狀態(tài)下均表達TLR4, 而活化狀態(tài)下的HSC則表達完整的TLR4/NF-κB信號通路在肝纖維化的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Shi等[30]研究表明, 當TLR4與LPS結合后, 通過MyD88-NF-κB通路激活HSC, 活化的HSC分泌TGFβ等重要纖維化因子, 同時又分化成為肌成纖維細胞并產生大量的ECM累積在肝組織中, 最終形成肝纖維化。

當然，女貪官腐敗還有諸多其他動機，例如僥幸心理、補償心理、攀比心理等。筆者認為，僥幸心理只是上述投機心理的別樣稱呼，基于不平衡心理而生的補償心理只是一種自我報償心理，仍不出“報償”的范疇，而攀比心理看似 “趨寡”實為“追風”，只是對“從眾”的表面偏離，仍屬從眾心理的范疇，故于此不再論述。

本實驗以小鼠和LSEC為研究對象，在動物層面證實莪術醇可以改善肝纖維化的病理改變；在細胞層面發(fā)現莪術醇可以明顯抑制TLR4和NF-κB的表達，對NF-κB的入核也有明顯的抑制。由此推測莪術醇可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用。具體的分子機制有待進一步的研究，為莪術醇臨床治療肝纖維化提供科學依據。