毛洋，丁寄葳，陳淑敏，岑山，李曉宇

研究報(bào)告

SLFN14抗LINE-1分子機(jī)制研究

毛洋，丁寄葳，陳淑敏，岑山，李曉宇

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室，北京 100050

長(zhǎng)散在核重復(fù)序列1 (long interspersed nuclear element-1, LINE-1)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的人體基因組中唯一具有自主轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其轉(zhuǎn)座常引起宿主基因組不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的各種嚴(yán)重基因疾病的發(fā)生。宿主因子在宿主抗LINE-1轉(zhuǎn)座中發(fā)揮著重要作用。宿主因子SLFN14作為免疫系統(tǒng)重要組成員，具有抗病毒活性。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)SLFN14對(duì)于LINE-1的轉(zhuǎn)座具有抑制作用。為進(jìn)一步探究其具體的作用機(jī)制，通過(guò)對(duì)LINE-1復(fù)制周期中的轉(zhuǎn)錄、翻譯、逆轉(zhuǎn)錄、整合環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，證實(shí)SLFN14能夠通過(guò)影響LINE-1 mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程及其半衰期，降低LINE-1 mRNA的水平，從而影響LINE-1蛋白及cDNA表達(dá)水平，最終導(dǎo)致LINE-1復(fù)制受阻。同時(shí)，通過(guò)對(duì)SLFN14活性中心的定位，本研究還發(fā)現(xiàn)SLFN14的抗LINE-1活性與其核糖核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。上述研究結(jié)果展示了SLFN14調(diào)控LINE-1復(fù)制的機(jī)制，進(jìn)一步完善了宿主因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為控制因LINE-1復(fù)制引起的基因組不穩(wěn)定提供了新思路。

轉(zhuǎn)座；逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子；LINE-1；SLFN14；5?-UTR內(nèi)部啟動(dòng)子區(qū)

轉(zhuǎn)座子，又被稱為轉(zhuǎn)座元件(transposable elements, TEs)，是一類能在基因組移動(dòng)的DNA重復(fù)序列，約占基因組總量的45%[1]。LINE-1是目前發(fā)現(xiàn)的人類基因組中唯一具有自主轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子，占據(jù)人類基因組的17%，其全長(zhǎng)約為6000 bp[2]，包括5'端和3'端的非翻譯區(qū)(untranslated regions, UTR)和兩個(gè)開(kāi)放式讀碼框架ORF1及ORF2 (open reading frame 1 protein, open reading frame 2 protein)。5'-UTR是其內(nèi)部啟動(dòng)子區(qū)域[3]；ORF1p是RNA結(jié)合蛋白，具有分子伴侶活性[4]；ORF2p具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和核酸內(nèi)切酶活性[5~8]。LINE-1的轉(zhuǎn)座方式為“復(fù)制–粘貼”型轉(zhuǎn)座，即在LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座過(guò)程中，首先RNA聚合酶II介導(dǎo)LINE-1啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄生成的LINE-1 RNA既能作為L(zhǎng)INE-1的基因組RNA，又能行使mRNA的功能。隨后，LINE-1 RNA出核，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，翻譯出ORF1p和ORF2p，兩者能與LINE-1 RNA結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物(ribonucleoprotein complexes, RNPs)。LINE-1 RNPs進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別宿主細(xì)胞基因組DNA上的目的序列，并在雙鏈DNA的其中一條鏈上切開(kāi)一個(gè)切口，逆轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)LINE-1 RNA逆轉(zhuǎn)錄生成LINE-1 cDNA，該過(guò)程被稱為靶位點(diǎn)引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄(target-site primed reverse transcription, TPRT)。最后，DNA的另一條鏈也被切開(kāi)，繼續(xù)進(jìn)行另一條DNA鏈的合成，LINE-1 cDNA被整合入到基因組中新的位點(diǎn)，完成逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座[9~11]。

LINE-1轉(zhuǎn)座對(duì)基因組的結(jié)構(gòu)和功能都會(huì)產(chǎn)生重要影響。在正常分化的細(xì)胞中，LINE-1啟動(dòng)子為高甲基化狀態(tài)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)座[12~15]；而在生殖細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育的早期則為激活狀態(tài)，一旦對(duì)其進(jìn)行抑制，小鼠胚胎無(wú)法正常發(fā)育[16]。由此可見(jiàn)，宿主細(xì)胞對(duì)LINE-1的活躍與抑制具有嚴(yán)格的調(diào)控。同時(shí)，各項(xiàng)研究表明LINE-1在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[17,18]，這表明在病理狀態(tài)下，活躍的LINE-1會(huì)對(duì)基因組結(jié)構(gòu)和功能造成不利影響進(jìn)而引起基因疾病和癌癥，這可能是由于LINE-1可以通過(guò)插入、缺失、重組和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式影響基因組的完整性和不穩(wěn)定性。因此，通常情況下，細(xì)胞會(huì)通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾、RNA干擾和宿主限制因子調(diào)控等手段對(duì)LINE-1的轉(zhuǎn)座進(jìn)行嚴(yán)格控制[19,20]。表觀遺傳學(xué)修飾主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾，它能在轉(zhuǎn)錄層面抑制LINE-1轉(zhuǎn)座；RNA干擾途徑主要在轉(zhuǎn)錄后層面抑制LINE-1轉(zhuǎn)座；宿主限制因子也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，目前已發(fā)現(xiàn)多種宿主限制因子能夠抑制LINE-1轉(zhuǎn)座活性[21]，其中包括APOBEC家族蛋白、SAMHD1蛋白以及本課題組正在研究的Schlafen (SLFN)家族蛋白。

SLFN家族作為胸腺細(xì)胞成熟和激活的調(diào)節(jié)劑被首次發(fā)現(xiàn)[22]，隨后多篇研究報(bào)道了它在其他細(xì)胞中的多種功能，如調(diào)控細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)和侵襲及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等[23]。這些研究證實(shí)SLFN蛋白是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗病毒復(fù)制和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用[23]。有研究證實(shí)，部分SLFN家族成員具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性，并且SLFN14作為SLFN家族成員之一已被證實(shí)是一種新型抗病毒因子[24,25]，考慮到LINE-1在復(fù)制周期上與逆轉(zhuǎn)錄病毒具有相似性，分析認(rèn)為SLFN14可能對(duì)LINE-1具有抑制作用。因此本研究對(duì)SLFN14是否具有抑制LINE-1轉(zhuǎn)座的活性進(jìn)行研究，并對(duì)其抗LINE-1活性位點(diǎn)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)SLFN14抗LINE-1機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T、HeLa細(xì)胞系(購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)的DMEM (購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司)。HEK293T細(xì)胞與HeLa細(xì)胞均以1∶6的比例進(jìn)行傳代，傳代后的細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，接種后2~3 d即可長(zhǎng)成致密單層。

1.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HEK293T與HeLa細(xì)胞系以合適的密度(轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒時(shí)細(xì)胞密度應(yīng)為70%~90%)接種于相應(yīng)的孔板中。接種24 h后，HEK293T細(xì)胞使用Lipo-fectamine 2000 (購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司)、HeLa使用TransEasy (購(gòu)自北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司)按說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4~6 h，之后更換細(xì)胞對(duì)應(yīng)的完全培養(yǎng)液正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后收樣。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)(retrotransposition assay)

對(duì)轉(zhuǎn)染48 h后的HeLa細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在六孔板中接種2.0×105個(gè)細(xì)胞/孔的HeLa細(xì)胞，用含有適宜濃度的G418培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。10~12 d后，用PBS潤(rùn)洗六孔板，每孔加入1 mL甲醇固定10 min，隨后結(jié)晶紫染色10 min，最后用蒸餾水沖洗干凈。對(duì)形成的細(xì)胞集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 總RNA、cDNA提取和Real-time PCR

按廣州美基生物科技有限公司的RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度。取2 μg所提取RNA，使用隨機(jī)引物通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行相對(duì)定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 2 min 15 s，40個(gè)循環(huán)。

按照QIAamp DNA Mini Kit基因組提取試劑盒說(shuō)明書要求提取cDNA，取2 μL cDNA進(jìn)行絕對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，72℃2 min 40 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 PCR擴(kuò)增所需引物序列

表2 PCR擴(kuò)增體系

1.5 免疫印跡(Western blot)分析

提取收集細(xì)胞總蛋白后，通過(guò)Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞系中SLFN14-flag或ORF1蛋白表達(dá)量。SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，恒壓電流濃縮膠70 V，分離膠120 V。濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，冰浴中以75 V恒壓電轉(zhuǎn)75 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。按照說(shuō)明書標(biāo)示比例加入一抗稀釋液(購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司)稀釋的β-actin抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，SC-47778)、flag抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，#14793)、ORF1p抗體(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原微生物研究所郭斐研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))，4℃輕搖過(guò)夜。次日，洗膜后按照體積比1∶5000比例加入PBST稀釋的二抗,室溫輕搖1 h。最后辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

HeLa細(xì)胞鋪Ф35 mm共聚焦專用皿，每皿接種5×104個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收細(xì)胞處理。PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次，4%細(xì)胞固定液室溫固定10 min；吸棄細(xì)胞固定液，加入0.02% Triton X-100溶液，室溫打孔10 min；PBS洗滌細(xì)胞3次，2% BSA溶液封閉1 h后，一抗孵育1 h；回收一抗，PBS洗滌細(xì)胞3次，熒光二抗孵育1 h；回收二抗，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入1~2滴含DAPI的封片液。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 Luciferase報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)

HEK293T鋪六孔板，轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞。細(xì)胞吹打混勻，吸取50 μL混勻的細(xì)胞液至白色底板中，加入50 μL 2×裂解液，混勻后置于37℃孵箱中放置25 min；將孵育好的樣品混勻后吸取10 μL至白色底板中，再加入40 μL luciferase熒光底物，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.8 LEAP (LINE-1 element amplification pro-tocol)實(shí)驗(yàn)

HeLa細(xì)胞鋪10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h后轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液裂解1 h后離心20 min，收集上清液。配置50 mL 8%和16%的蔗糖溶液(1 mol/L NaCl 1.6 mL，0.1 mol/L MgCl22.5 mL，1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 1 mL，1 mol/L DTT 50 μL，蛋白酶抑制劑1片，無(wú)RNA酶水45 mL及4 g或8 g蔗糖)。隨后將配制好的蔗糖溶液加入到超速離心管中，上層加入裂解液，4℃超速離心41,000 r/min，3 h。超速離心后用100 μL無(wú)RNA酶水溶解離心管底部樣品，1∶1加入甘油，–20℃保存。取一部分樣品定量后，取適量樣品加入到49 μL LEAP反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系組分見(jiàn)表3。37℃孵育1 h，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，測(cè)定各組cDNA量。LEAP實(shí)驗(yàn)所需引物序列見(jiàn)表4。

1.9 RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

HEK293T鋪六孔板，轉(zhuǎn)染24 h后用放線菌素D (5 μg/mL)進(jìn)行處理，分別于0、0.5、1、2、4、8 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。利用Real-time PCR對(duì)LINE-1 RNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5 進(jìn)行處理，以3次實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。組間比較用檢驗(yàn)。

表3 LEAP孵育體系

表4 LEAP實(shí)驗(yàn)所需引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SLFN14抑制LINE-1轉(zhuǎn)座

為確定SLFN14能否抑制LINE-1轉(zhuǎn)座活性，本研究進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)是利用Thierry Heidmann實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告質(zhì)粒CMV-LINE-1-NEORT(以下簡(jiǎn)稱LINE-1質(zhì)粒)，該質(zhì)粒在LINE-1的3?-UTR上游設(shè)計(jì)了一個(gè)含有內(nèi)含子的新霉素()抗性基因，此基因只有在LINE-1質(zhì)粒成功進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座去除內(nèi)含子后才能表達(dá)新霉素抗性(圖1A)。在含有G418抗性的培養(yǎng)基中，含有成功進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座LINE-1的HeLa細(xì)胞才能存活，并形成細(xì)胞集落，細(xì)胞集落數(shù)目的多少便能反映LINE-1轉(zhuǎn)座效率的高低[26]。

在HeLa細(xì)胞中，共同轉(zhuǎn)染LINE-1與不同濃度的SLFN14-flag質(zhì)粒，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)染量SLFN14-flag對(duì)含LINE-1細(xì)胞的集落形成產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，隨著SLFN14表達(dá)的增加，LINE-1形成的細(xì)胞集落數(shù)量有明顯的下降(圖1B)。此結(jié)果表明，外源表達(dá)的SLFN14能明顯抑制LINE-1轉(zhuǎn)座且這種抑制活性與SLFN14的表達(dá)呈劑量依賴性關(guān)系。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，隨著SLFN14表達(dá)量的增加，LINE-1 ORF1p的表達(dá)也在下降，而且下降的幅度與LINE-1轉(zhuǎn)座水平下降的趨勢(shì)一致(圖1C)，這表明SLFN14有可能直接抑制LINE-1 ORF1p蛋白的表達(dá)，抑或是通過(guò)抑制LINE-1 RNA表達(dá)水平來(lái)降低ORF1p蛋白的表達(dá)?；诖朔治?，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將直接通過(guò)檢測(cè)ORF1p的表達(dá)量來(lái)反映SLFN14對(duì)LINE-1轉(zhuǎn)座的影響。

圖1 SLFN14抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座

A：逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)原理示意圖。抗性基因中含有一段反向的內(nèi)含子，此基因只有在LINE-1質(zhì)粒成功進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座去除內(nèi)含子后才能表達(dá)新霉素抗性。B：逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染0、100、200、400 ng SLFN14-flag及1000 ng LINE-1質(zhì)粒后LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座形成的細(xì)胞集落數(shù)量變化。將未轉(zhuǎn)染SLFN14-flag的對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)目看作100；*：< 0.05，***：< 0.001。C：免疫印跡法檢測(cè)SLFN14對(duì)LINE-1 ORF1p表達(dá)的影響。

2.2 SLFN14抑制LINE-1的結(jié)構(gòu)域分析

SLFN14包括3個(gè)分別具有內(nèi)切核糖核酸酶活性、核糖體結(jié)合功能和解旋酶活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，因此本研究分別構(gòu)建了缺失以上3個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的SLFN14 dC1、dC2、dC3、dN1、dN2、dN3六個(gè)截短體(圖2A)以對(duì)不同結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

從2.1實(shí)驗(yàn)可知，SLFN14對(duì)LINE-1轉(zhuǎn)座的影響可以通過(guò)LINE-1 ORF1p的表達(dá)體現(xiàn)。因此，為確定SLFN14 dC1、dC2、dC3、dN1、dN2、dN3六個(gè)截短體是否仍然具有抗LINE-1活性，本研究共同轉(zhuǎn)染LINE-1與SLFN14的六個(gè)截短體質(zhì)粒，并以SLFN14野生型作為對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)ORF1p蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)與野生型SLFN14相比，dC1和dC2依然能夠一定程度抑制ORF1p的表達(dá)活性，證明SLFN14的C端的解旋酶結(jié)構(gòu)域不是SLFN14抑制LINE-1轉(zhuǎn)座活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域；另一方面dN3的表達(dá)對(duì)LINE-1 ORF1p的影響與未轉(zhuǎn)染SLFN14-flag質(zhì)粒的空白對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異，這提示dN3完全喪失了抗LINE-1活性(圖2B)。此結(jié)果表明SLFN14解旋酶結(jié)構(gòu)域在其抗LINE-1活性中可能作用有限，而內(nèi)切核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域與核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域在其中發(fā)揮重要作用。

利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)SLFN14及其截短體在細(xì)胞中的分布情況進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，保留主要抗LINE-1活性的dC1的細(xì)胞定位情況與野生型完全一致，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；而完全喪失了抗LINE-1活性的SLFN14 dN3則有明顯彌散現(xiàn)象，在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有分布(圖2C)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SLFN14 dN3不抑制LINE-1 ORF1p表達(dá)?；诖?，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以SLFN14 dN3為陰性對(duì)照進(jìn)行SLFN14抗LINE-1活性的機(jī)制研究。

圖2 SLFN14抑制LINE-1轉(zhuǎn)座的活性結(jié)構(gòu)域定位

A：SLFN14野生型及各個(gè)截短體結(jié)構(gòu)域示意圖。B：Western blot檢測(cè)HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SLFN14-flag野生型及各個(gè)截短體質(zhì)粒時(shí)對(duì)ORF1p表達(dá)情況的影響。將轉(zhuǎn)染LINE-1及pcDNA4.0質(zhì)粒組作為陰性對(duì)照，將轉(zhuǎn)染LINE-1及SLFN14-flag野生型質(zhì)粒組作為陽(yáng)性對(duì)照。C：免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SLFN14-flag野生型及各個(gè)截短體質(zhì)粒時(shí)SLFN14蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

2.3 SLFN14并非通過(guò)影響ORF2p逆轉(zhuǎn)錄酶活性影響LINE-1 cDNA水平

以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)SLFN14可以抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，這意味著SLFN14可能會(huì)減少插入宿主基因組的LINE-1拷貝數(shù)。為驗(yàn)證SLFN14是否會(huì)減少插入到細(xì)胞基因組中的LINE-1 cDNA，本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，其中正向引物只與拼接的基因結(jié)合，這樣只有從拼接的RNA中逆轉(zhuǎn)錄的LINE-1 cDNA才能被擴(kuò)增(圖3A)。與僅轉(zhuǎn)染LINE-1質(zhì)粒的對(duì)照組相比，SLFN14的表達(dá)呈劑量依賴性地降低LINE-1 cDNA水平(圖3B)，而SLFN14 dN3的表達(dá)不降低LINE-1 cDNA水平(圖3C)。

SLFN14減少LINE-1 cDNA拷貝數(shù)的原因有多種，最可能的是影響了LINE-1 ORF2p逆轉(zhuǎn)錄酶的活性或直接減少了其RNA的拷貝數(shù)，為此首先采用LEAP實(shí)驗(yàn)來(lái)給予驗(yàn)證。利用細(xì)胞內(nèi)各組分沉降系數(shù)的差異進(jìn)行差速離心，分離各個(gè)組分，通過(guò)超速區(qū)帶離心分離得到LINE-1 RNP。對(duì)其定量后，利用RNP中自帶的ORF2p以及LINE-1 RNA模板模擬TPRT過(guò)程，反轉(zhuǎn)錄出LINE-1 cDNA并用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行定量[27]。在等量RNP的情況下，檢測(cè)SLFN14對(duì)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的影響，結(jié)果顯示SLFN14不影響LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程(圖3D)，提示SLFN14對(duì)LINE-1 cDNA的影響并非通過(guò)影響LINE-1 ORF2p逆轉(zhuǎn)錄酶活性而實(shí)現(xiàn)的。由于LINE-1 RNA同時(shí)作為編碼蛋白質(zhì)的mRNA和RNA中間體產(chǎn)生新的cDNA拷貝，因此SLFN14更可能是影響了LINE-1 RNA 的轉(zhuǎn)錄，SLFN14影響LINE-1 ORF1p表達(dá)同樣證明了這一觀點(diǎn)。

2.4 SLFN14降低LINE-1 RNA水平

將LINE-1和不同濃度的SLFN14質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，然后Real-time PCR測(cè)定總LINE-1 RNA，結(jié)果顯示，隨著SLFN14的增加，LINE-1 RNA明顯下降且呈劑量依賴性(圖4A)，SLFN14 dN3則與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(圖4B)，這表明SLFN14影響了LINE-1 RNA水平。

圖3 SLFN14并非通過(guò)影響ORF2p逆轉(zhuǎn)錄酶活性而影響LINE-1 cDNA水平

A：擴(kuò)增LINE-1 cDNA的引物示意圖。此正向引物被設(shè)計(jì)成只與拼接的耐新霉素基因結(jié)合，這樣只有從拼接的RNA中逆轉(zhuǎn)錄的LINE-1 cDNA才能被擴(kuò)增。B：Real-time PCR檢測(cè)梯度轉(zhuǎn)染野生型SLFN14后LINE-1 cDNA的變化情況。C：Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型SLFN14及截短體SLFN14 dN3后LINE-1 cDNA的變化情況。D：LEAP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ORF2p逆轉(zhuǎn)錄活性對(duì)LINE-1 cDNA水平的影響。將轉(zhuǎn)染LINE-1及pcDNA4.0質(zhì)粒組作為陰性對(duì)照組；*：< 0.05；**：<0.01；***：< 0.001；：無(wú)顯著性差異。

圖4 SLFN14能夠降低LINE-1 RNA水平

A：Real-time PCR檢測(cè)梯度轉(zhuǎn)染野生型SLFN14后LINE-1 RNA的變化情況。B：Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型SLFN14及截短體SLFN14 dN3后LINE-1 RNA的變化情況。轉(zhuǎn)染LINE-1及pcDNA4.0質(zhì)粒組作為陰性對(duì)照組；***：< 0.001；：無(wú)顯著性差異。C：Real-time PCR檢測(cè)放線菌素D處理后不同時(shí)間段SLFN14對(duì)LINE-1 RNA降解情況的影響。

那么SLFN14是在轉(zhuǎn)錄前還是轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用呢？有研究證實(shí)兔源SLFN14具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠降解RNA[28]。因此本研究利用放線菌素D能夠抑制RNA聚合酶II活性的特性，通過(guò)測(cè)量LINE-1 RNA的衰減變化進(jìn)而驗(yàn)證SLFN14是否對(duì)LINE-1 RNA穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。將LINE-1和SLFN14質(zhì)粒(1 mg)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24 h后放線菌素D(5 μg/mL)處理，于0、0.5、1、2、4、8 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，利用Real-time PCR對(duì)LINE-1 RNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，SLFN14對(duì)于LINE-1 RNA降解有作用(圖4C)，這表明SLFN14可以在轉(zhuǎn)錄后水平影響LINE-1 RNA的降解。

2.5 SLFN14通過(guò)抑制LINE-1 5?-UTR的內(nèi)部啟動(dòng)子來(lái)抑制LINE-1 RNA的產(chǎn)生

SLFN14是否也會(huì)在LINE-1轉(zhuǎn)錄前水平發(fā)揮作用呢？LINE-1的5?-UTR包含具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能的啟動(dòng)子，這對(duì)于LINE-1的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。為確定SLFN14是否影響LINE-1啟動(dòng)子活性，將LINE-1 5?-UTR啟動(dòng)子序列克隆至pGL3-basic啟動(dòng)子活性報(bào)告質(zhì)粒(圖5A)，該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)下游是一個(gè)缺少啟動(dòng)子序列的熒光素酶(luciferase)序列，只有在其上游插入具有啟動(dòng)子活性的序列，才能被激活進(jìn)而表達(dá)出熒光素酶，而后加入相應(yīng)底物，便可以通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定生物熒光變化，反映基因的表達(dá)情況。在排除SLFN14對(duì)CMV強(qiáng)啟動(dòng)子影響(圖5B)后，結(jié)果顯示，野生型SLFN14會(huì)極大程度地抑制LINE-1 5?-UTR啟動(dòng)子活性(圖5C)，而SLFN14 dN3則無(wú)抑制作用(圖5D)，這表明SLFN14也可以在轉(zhuǎn)錄前水平抑制了LINE-1 5?啟動(dòng)子活性從而抑制LINE-1 RNA表達(dá)，最終影響LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座。

3 討論

近年來(lái)對(duì)SLFN家族成員，特別是SLFN14的研究較少，其功能還沒(méi)有被了解完全。迄今為止對(duì)SLFN14唯一的功能描述是稱其為一真正的哺乳動(dòng)物內(nèi)切核糖核酸酶，而目前對(duì)SLFN14病理性研究主要集中于血液病方向，SLFN14是最近發(fā)現(xiàn)的與遺傳性血小板減少相關(guān)的基因之一，研究認(rèn)為SLFN14可能參與了血小板形成和成熟過(guò)程及核糖體的降解[29~32]。此外，有研究表明在流感病毒感染時(shí)SLFN14表達(dá)于細(xì)胞核，并對(duì)流感病毒的核蛋白(nuclearprotein, NP)表達(dá)進(jìn)行限制[25]，這提示SLFN14可能與NP相互作用。對(duì)此，本課題組也對(duì)SLFN14與LINE-1核蛋白ORF1p的相互作用進(jìn)行探究，但卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩者存在相互作用(結(jié)果未顯示)。這提示SLFN14抗LINE-1轉(zhuǎn)座機(jī)制可能與其抗流感感染機(jī)制不同，SLFN14是通過(guò)間接作用影響LINE-1 ORF1p的表達(dá)。

圖5 SLFN14能夠通過(guò)抑制LINE-1 5?-UTR啟動(dòng)子活性來(lái)抑制LINE-1轉(zhuǎn)座

A：用于檢測(cè)LINE-1 5?-UTR活性的LINE-1-FL質(zhì)粒示意圖。B：Luciferase啟動(dòng)子活性報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型SLFN14對(duì)CMV啟動(dòng)子活性的影響。C：Luciferase啟動(dòng)子活性報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染野生型SLFN14后對(duì)LINE-1 5?-UTR內(nèi)部啟動(dòng)子活性的影響。D：Luciferase啟動(dòng)子活性報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染SLFN14截短體dN3對(duì)LINE-1 5?-UTR內(nèi)部啟動(dòng)子活性的影響。*：< 0.05，***：< 0.001，：無(wú)顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)SLFN14的序列進(jìn)行了分析，經(jīng)蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)工具網(wǎng)站(https://www.genscript. com/psort.html)比對(duì)，SLFN14具有核定位序列，預(yù)測(cè)其核定位序列為PRVKKLH。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型SLFN14主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)此，F(xiàn)letcher等[32]同樣證實(shí)了這一點(diǎn)，即SLFN14主要定位于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，在細(xì)胞核中僅有少量點(diǎn)狀分布。然而，SLFN14截短體的細(xì)胞分布卻發(fā)生了顯著變化，喪失抗LINE-1活性的截短體dN3在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中彌散分布。因此推測(cè)一旦SLFN14大量停留在細(xì)胞核中，便會(huì)喪失抗LINE-1活性。這表明正確的細(xì)胞分布對(duì)于SLFN14的抗LINE-1活性至關(guān)重要，細(xì)胞分布的改變會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生負(fù)面影響。

通過(guò)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// www.proteinatlas.org/)分析SLFN14在細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平低，且經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)細(xì)胞系無(wú)內(nèi)源SLFN14蛋白表達(dá)，因此沒(méi)有對(duì)內(nèi)源SLFN14的抗LINE-1轉(zhuǎn)座活性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，具有一定的局限性。同時(shí)，SLFN14更詳細(xì)的抗LINE-1轉(zhuǎn)座作用機(jī)制，特別是與SLFN14通過(guò)何種方式影響LINE-1 5?-UTR的相關(guān)分子機(jī)制研究還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SLFN14可以抑制LINE-1的轉(zhuǎn)座活性，并將其活性中心定位于N端的核糖核酸內(nèi)切酶及核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域上，此部分的缺失會(huì)導(dǎo)致SLFN14細(xì)胞定位發(fā)生變化，從而使SLFN14喪失抗LINE-1活性；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)SLFN14能夠在轉(zhuǎn)錄前通過(guò)抑制LINE-1 5?啟動(dòng)子活性從而降低LINE-1 RNA產(chǎn)生，也能在轉(zhuǎn)錄后加速LINE-1 RNA的降解，隨后減少LINE-1 ORF1p及cDNA的表達(dá)，最終抑制了LINE-1的轉(zhuǎn)座。

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SLFN14 inhibits LINE-1 transposition activity

Yang Mao, Jiwei Ding, Minshu Chen, Shan Cen, Xiaoyu Li

Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) is the only active autonomous transposon in the human genome. Its transposition frequently induces host genome instability, leading to a variety of genetic diseases, including cancers. The host factors play important roles in inhibiting LINE-1 retrotransposition. As an important component of the immune system, the host factor SLFN14 has antiviral activity. Our laboratory shows that SLFN14 possesses potent inhibitory activity against LINE-1 retrotransposition. To explore the potential mechanism of SLFN14 inhibition, we analyzed its effects on transcription, translation, reverse transcription and insertion in the LINE-1 replication cycle. We confirmed that SLFN14 could suppress the LINE-1 mRNA level by affecting its transcription and degradation, thereby diminishing the protein and cDNA levels of LINE-1, which eventually block the LINE-1 retrotransposition. Further, by mapping the active domains of SLFN14, we found its inhibitory activity on LINE-1 being closely related to its endoribonuclease and ribosome binding domains. These results demonstrate the mechanism of SLFN14 in regulating LINE-1 replication, which further provide new insights for improving the regulation network of host factors for controlling genomic instability caused by LINE-1 replication.

transposition; retrotransposon; LINE-1; SLFN14; 5 ?-UTR internal promotor region

2020-04-26;

2020-05-22

國(guó)家科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2018ZX10301408-004)和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康創(chuàng)新工程項(xiàng)目(編號(hào)：CIFMS 2016-I2M-2-002)資助[Supported by the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2018ZX10301408-004)] and Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (No. CIFMS 2016-I2M- 2-002)]

毛洋，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：宿主因子對(duì)轉(zhuǎn)座子調(diào)控機(jī)制研究。E-mail: yangmao-MY@outlook.com

李曉宇，博士，副研究員，研究方向：病毒學(xué)。E-mail: xiaoyulik@hotmail.com

岑山，博士，研究員，研究方向：病毒學(xué)。E-mail: shancen@imb.pumc.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-081

2020/5/26 10:53:37

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200525.1400.002.html

(責(zé)任編委: 宋旭)