梭狀芽孢桿菌對(duì)DON處理生長(zhǎng)豬腸道屏障和菌群區(qū)系的影響

楊婉瑩，陳紅菊，袁學(xué)軍，王鵬巍，黃麗波，王春陽

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/山東省動(dòng)物生物技術(shù)與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271018)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名嘔吐毒素，是鐮刀菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于玉米、小麥、大麥等谷物及其產(chǎn)品中[1-2]。DON可通過食物鏈對(duì)人畜造成危害，低濃度的DON能引起動(dòng)物生產(chǎn)性能降低，采食量下降，體增重、飼料的轉(zhuǎn)化率差，而高濃度的DON可導(dǎo)致人和動(dòng)物嘔吐、腹瀉、免疫異常甚至死亡[3-4]。DON分布廣泛，2016年我國(guó)20個(gè)省市飼料及飼料原料DON污染狀況分析結(jié)果顯示，谷物及飼料原料受DON污染相當(dāng)嚴(yán)重，中等程度以上的污染水平均超過60%[5]。

DON化學(xué)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，有較強(qiáng)的酸性和耐熱性，在350℃的高溫下仍能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這也是其在飼料中普遍存在的重要原因之一[6]。目前常用的DON脫毒方法有物理、化學(xué)和生物法，但物理和化學(xué)方法脫毒效果不理想，同時(shí)會(huì)破壞食物原料中的營(yíng)養(yǎng)成分，還易造成二次污染[7-8]，而微生物降解毒素的方法因其高效環(huán)保而受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物腸道的混合微生物菌團(tuán)對(duì)DON的降解率可接近50%[9-10]，芽孢桿菌屬中的某些菌株甚至可達(dá)80%以上[11-12]，但多數(shù)的相關(guān)研究都是用單株菌株直接與DON標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行體外降解試驗(yàn)，沒有驗(yàn)證其在動(dòng)物腸道環(huán)境中對(duì)DON的降解效率和動(dòng)物使用的安全性。

腸道是DON毒性作用的主要靶標(biāo)，而腸道屏障的完整性和腸道菌群的多樣性與DON的毒性作用密切相關(guān)。因此，本試驗(yàn)以生長(zhǎng)豬為研究對(duì)象，以體外試驗(yàn)DON降解率大于90%的梭狀芽孢桿菌(Clostridium)為解毒菌，從腸道屏障和腸道菌群多樣性的角度探討Clostridium對(duì)DON處理豬的保護(hù)作用和安全性，以期為DON生物降解的實(shí)踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株Clostridium(CN102485883.B)，L10培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。產(chǎn)DON真菌株(Fusariumgraminearum)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所王金全博士惠贈(zèng)，于大米培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)7 d,烘干粉碎得到DON的粗產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)日糧，試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)日糧參考美國(guó)NRC(2012)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制(表1)，污染日糧是在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加終質(zhì)量濃度為5 mg/kg的DON，試驗(yàn)所需的所有飼料在試驗(yàn)開始前7 d一次性配制完成。飼料中DON、AFB1、ZEA和 FB1均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所采用LC-MC檢測(cè)方法檢測(cè)。

表1 基礎(chǔ)日糧成分及營(yíng)養(yǎng)水平表

試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取4月齡日齡體質(zhì)量為(55.58±1.83)kg的健康PIC父母代生長(zhǎng)豬24頭，隨機(jī)分為3組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，組間初始體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組：飼喂基礎(chǔ)飼糧；DON組：飼喂5 mg/kg DON污染日糧；DON+C組：在飼喂污染飼料的基礎(chǔ)上，添加Clostridium菌液(15 mL/kg)。預(yù)試期7 d，正試期28 d。試驗(yàn)期間自由采食和飲水，飼養(yǎng)和免疫按常規(guī)程序進(jìn)行。

試驗(yàn)結(jié)束后，每組屠宰3頭，將仔豬電擊、放血致死。剖開腹腔后迅速將各個(gè)腸段結(jié)扎分離，用無菌刀片切取回腸、盲腸和結(jié)腸組織(各腸段中段取樣)約2 cm,并迅速放入含2.5% 戊二醛的固定液中。同時(shí)采集回腸、盲腸和結(jié)腸的腸內(nèi)容物并立即置于液氮中保存。

1.3 組織樣品的電鏡觀察將固定液中的腸道組織塊，經(jīng)酒精梯度乙醇脫水、冷凍干燥、噴金等程序后，應(yīng)用高分辨激光共聚焦與掃描電鏡(ZEISS公司，德國(guó))進(jìn)行掃描拍照。

1.4 腸道微生物測(cè)序及其群落分析提取腸道內(nèi)容物中的微生物總DNA,測(cè)定DNA濃度和純度，然后每組每個(gè)腸段的DNA樣品等量混合為1個(gè)樣品。

16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)豬腸道菌群結(jié)構(gòu)。引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′) 用于擴(kuò)增16S rRNA 基因V3-V4可變區(qū)?；贗llumina HiSeq2500(北京諾和生物信息技術(shù)有限公司)測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序。通過對(duì)Reads拼接過濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品物種構(gòu)成；并通過α多樣性分析(Alpha Diversity)和β多樣性分析(Beta Diversity)挖掘樣品之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 腸道的組織形態(tài)學(xué)電鏡觀察結(jié)果顯示，正常對(duì)照組的回腸、盲腸和結(jié)腸絨毛排列整齊，形態(tài)完整；飼喂DON后，各個(gè)腸段絨毛均表現(xiàn)出不同程度的損傷，其中回腸部分的受損最為嚴(yán)重，絨毛上皮大片脫落，腸道形態(tài)不再完整；添加Clostridium后，小腸絨毛損傷破裂的現(xiàn)象明顯得到緩解(圖1～3)。

圖1 回腸黏膜的掃描電鏡圖(n=3)

圖2 盲腸黏膜的掃描電鏡圖(n=3)

圖3 結(jié)腸黏膜的掃描電鏡圖(n=3)

2.2 腸道菌群豐度及多樣性分析采用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)獲得的用于后續(xù)分析的有效序列和平均長(zhǎng)度。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，平均每個(gè)樣品有42 045條有效序列，其平均長(zhǎng)度是388 bp。Chao指數(shù)反映微生物豐度，Shannon指數(shù)反映微生物的多樣性。在同一腸段，各組間Chao和Shannon 指數(shù)差異均不顯著。3個(gè)腸段中，盲腸的Chao和Shannon指數(shù)最高，而回腸的最低，反映了盲腸和結(jié)腸中微生物的豐度和多樣性均高于回腸。

2.3 微生物在門水平和種屬水平的變化根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每組樣品在門水平上最大豐度排名前10的物種(圖4)。從圖中可見所有處理組的厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度最高(>72%)；飼喂DON污染飼料后，回腸和結(jié)腸Firmicutes的相對(duì)豐度顯著降低，而回腸和結(jié)腸的擬桿菌門(Bacteroidetes)及回腸的螺旋體門(Spirochaetes)的相對(duì)豐度顯著增加；添加Clostridium后，這些細(xì)菌的數(shù)量并沒有受到顯著影響。結(jié)果表明，DON對(duì)回腸和結(jié)腸的優(yōu)勢(shì)菌群有較明顯的影響，但對(duì)盲腸優(yōu)勢(shì)菌群影響不大。

表2 微生物豐度與多樣性分析

圖4 各組樣品前10名物種分布柱狀圖(門水平) 不能進(jìn)入前10名的序列被指定為“others”序列。下同

在種屬水平上，生長(zhǎng)豬回腸排前三的優(yōu)勢(shì)菌群分別是乳酸菌(Lactobacillus)(18.7%)、毛螺旋菌(Trichospirillum)(12.7%)和瘤胃球菌(Ruminococccaceae)(9.2%)。飼喂DON后，Lactobacillus和Trichospirillum分別降至5.5%和2.1%，Ruminococccaceae增加至36.5%%。添加Clostridium后，雖然Lactobacillus(9.5%)較之對(duì)照組還明顯降低，但是Clostridium明顯增加，從7.4%上升至14.9%。其他菌種的相對(duì)豐度較對(duì)照組未有明顯的變化(圖3-回腸)。

盲腸排前三的優(yōu)勢(shì)菌群分別是Lactobacillus(14.1%)，Trichospirillum(12.7%)和Clostridium(7.8%)。飼喂DON后，Lactobacillus和Trichospirillum分別降至6.0%和6.2%，Clostridium未有明顯變化。添加Clostridium后，Lactobacillus(9.6%)較之對(duì)照組還明顯降低，但是Clostridium明顯增加至15.8%，成為盲腸中最多的優(yōu)勢(shì)菌群。值得關(guān)注的是，盲腸部分對(duì)照組、DON組和DON+C組的“其他類”分別為44.8%,54.5%和48.1%，這一數(shù)據(jù)均明顯高于同一處理組回腸和結(jié)腸段的相對(duì)豐度值，可能提示盲腸的菌種數(shù)更多，也更為復(fù)雜。

結(jié)腸排前三的優(yōu)勢(shì)菌群分別是Christensenellaceae(10.4%)，Lactobacillus(10.1%)和Subdoligranulum(9.2%)，與回腸和盲腸有較大的差異。飼喂DON后，Lactobacillus和Subdoligranulum分別降至3.9%和5.6%。Ruminococccaceae從3.1%升至7.2%，而消化鏈球菌屬從7.9%降至2.0%。應(yīng)用Clostridium后，除了Clostridium從6.3%升至14.1%及Subdoligranulum(3.5%)明顯低于對(duì)照組外，其他幾種均較對(duì)照組變化不明顯。

2.4 樣品組內(nèi)和組間分析樣品的組間分析見圖6a，花瓣圖中每個(gè)花瓣代表1個(gè)樣品組，不同的顏色代表不同的樣品組，中間的core數(shù)字代表的是所有樣品共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該樣品組特有的OTU數(shù)目,結(jié)果顯示組間差異不顯著。樣品間的分析見圖6b，樣本的組成越相似，NUMDS圖中顯示的距離越近。結(jié)果表明，各處理組間回腸部分的差異最為顯著。

圖5 各組樣品間種屬水平前10名物種分布 A.回腸；B.盲腸；C.結(jié)腸

圖6 腸道樣品分析 A.組內(nèi);B.組間

3 討論

3.1 DON與腸道形態(tài)完整性腸道不僅是動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，也是機(jī)體抵抗外源病原物入侵的天然屏障。腸道屏障的完整性是有效預(yù)防腸道細(xì)菌，毒素、炎癥介質(zhì)和其他有害物質(zhì)通過腸黏膜進(jìn)入血液的第1道屏障[13]。DON主要被小腸吸收，它可以通過腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)和分布系統(tǒng)，到達(dá)周圍器官，從而影響細(xì)胞的活性和功能。DON會(huì)引起動(dòng)物的腸道組織的損傷，而且DON對(duì)腸道形態(tài)的影響程度受DON濃度、侵染時(shí)間，和動(dòng)物的年齡的不同而有所不同[14-16]。豬是對(duì)DON最為敏感的動(dòng)物，許多的數(shù)據(jù)都是關(guān)于斷奶仔豬的研究，關(guān)于生長(zhǎng)豬的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少。

本研究結(jié)果表明，DON處理組生長(zhǎng)豬的回腸、盲腸和結(jié)腸的微觀結(jié)構(gòu)均不同程度受到損傷，其中回腸段損傷最為明顯，而結(jié)腸段損傷最輕，這可能是由于豬盲腸和回腸中的某些微生物能夠降解DON，也有可能在前段腸段中有部分DON被破壞吸收，到盲腸和結(jié)腸中的DON量減少，降低了DON的損傷作用。DON可以通過破壞腸道屏障的完整性從而誘發(fā)腸道病變，這與之前的研究結(jié)果一致[17]。添加Clostridium后，DON對(duì)生長(zhǎng)豬腸道屏障的損傷雖然要強(qiáng)于對(duì)照組，但較之DON處理組明顯減輕。Clostridium可以通過降解DON的毒性作用，從而保護(hù)腸道屏障的完整性。

3.2 DON與腸道微生的區(qū)系DON在腸道中主要通過旁細(xì)胞途徑，在小腸上端以被動(dòng)擴(kuò)散的方式被快速有效地吸收，DON的毒性作用與其吸收入血的速度和效率成正相關(guān)。DON的吸收率在動(dòng)物中表現(xiàn)出較大的差異，豬、雞、羊和牛的吸收率分別為82%，19%，9.9%和1%，這些差異主要與動(dòng)物小腸前后菌群的分布有關(guān)[18]。DON在進(jìn)入反芻動(dòng)物和家禽小腸之前，就被腸道微生物降解。對(duì)于人類和單胃動(dòng)物來說，DON不能在胃中被水解，同時(shí)小腸前部微生物菌群較少，所以人類和豬對(duì)DON的敏感性高于家禽和反芻動(dòng)物[19]。

動(dòng)物的消化道，特別是哺乳動(dòng)物的消化道，非常適合微生物的大規(guī)模繁殖，哺乳動(dòng)物胃腸道寄宿著大約1014個(gè)微生物，是一個(gè)最密集的微生態(tài)系統(tǒng)，保持腸道菌群的平衡對(duì)維持動(dòng)物良好健康至關(guān)重要。雖然有跡象表明嘔吐毒素暴露可能破壞共生菌的平衡和多樣性并會(huì)引起生態(tài)失調(diào)，但有關(guān)DON對(duì)腸道菌群的潛在影響的文獻(xiàn)仍較少。有研究顯示，給大鼠飼喂DON (100 μg/kg)4周后，擬桿菌數(shù)量顯著增加，而腸道中擬桿菌屬的增殖與腹腔疾病發(fā)生和炎性腸病有關(guān)[20]。也有研究觀察到嘔吐毒素暴露(136 μg/kg)改變了腸道后部的菌群，從而導(dǎo)致嗜溫需氧菌增加，還原性亞硫酸鹽厭氧菌減少[21]。本試驗(yàn)通過16S rRNA基因測(cè)序，研究Clostridium和DON對(duì)生長(zhǎng)豬腸道菌群多樣性的影響。結(jié)果顯示，在門水平上Firmicutes為優(yōu)勢(shì)菌群，占72%以上。Spirochaetes位于第2優(yōu)勢(shì)菌群。當(dāng)給豬飼喂DON污染飼料后，回腸和結(jié)腸段擬桿門菌相對(duì)豐度均明顯增加。

在種屬水平中，回腸、盲腸和結(jié)腸中Lactobacillus的數(shù)量最多，回腸中尤其多。在DON組和Clostridium添加組，Lactobacillus的豐度在幾個(gè)腸段均顯著下降。添加Clostridium后，腸道中的Clostridium相對(duì)豐度明顯增加，說明Clostridium能夠在豬腸道中定植，這也可能是Clostridium能夠保護(hù)腸道健康，抵抗DON毒性作用的重要原因。本研究結(jié)果還顯示，回腸和結(jié)腸的腸道菌群結(jié)構(gòu)受DON的影響明顯，而盲腸變化不明顯。

綜上所述，本試驗(yàn)從腸道屏障完整性及腸道菌群多樣性兩個(gè)方面探討了Clostridium對(duì)DON處理豬的保護(hù)作用，但仍需進(jìn)一步研究其作用機(jī)制并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，為DON的生物降解開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。