周國(guó)華*，葉明強(qiáng)，吳騰育

(清潔能源材料化學(xué)廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東湛江 524048)

基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)的熒光傳感器，由于其高分辨率、高選擇性、可操作性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，吸引了眾多科研工作者的興趣，已經(jīng)被研發(fā)并應(yīng)用于重金屬離子[1]、DNA甲基化[2]、真菌毒素[3]、蛋白質(zhì)[4]和酶活[2,3，5,6]等的不同檢測(cè)中。FRET熒光傳感器包含了熒光能量供體和能量受體。熒光能量供體是熒光傳感器研究的重點(diǎn)之一，目前主要為有機(jī)熒光分子和新型熒光納米材料，如量子點(diǎn)[7,8]、碳點(diǎn)[9]、金屬團(tuán)簇[10]等。事實(shí)上，熒光能量受體的選擇和研究對(duì)于FRET傳感器亦是至關(guān)重要。合適的能量受體能使熒光背景更低，從而帶來(lái)更高的檢測(cè)靈敏度。傳統(tǒng)的能量受體主要為有機(jī)小分子，包括各熒光分子和不發(fā)熒光的猝滅劑，如BHQ系列猝滅劑。當(dāng)使用兩個(gè)熒光分子構(gòu)成熒光能量供-受體對(duì)時(shí)，能量受體所發(fā)射的熒光會(huì)進(jìn)入供體的檢測(cè)通道，形成背景信號(hào)，限制了方法的靈敏度。BHQ的使用有效解決了該問(wèn)題，使FRET熒光探針的靈敏度有所提高[11]。近十幾年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)一些具有特殊光學(xué)性質(zhì)的納米材料也能夠充當(dāng)性能優(yōu)異的熒光能量受體。相比有機(jī)小分子，納米材料具有更寬的吸收光譜和更高的摩爾吸光系數(shù)[12]，更容易與熒光光譜匹配，具有更高的能量轉(zhuǎn)移效率和猝滅效率。以納米材料和熒光小分子組成能量供-受體對(duì)，其Stern-Volmer猝滅常數(shù)(KSV)達(dá)到107～1011L/mol，是小分子能量供-受體對(duì)KSV的5～6個(gè)數(shù)量級(jí)[13]，從而帶來(lái)更低的背景和更高的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，納米材料可以通過(guò)不同配體的修飾實(shí)現(xiàn)各種功能化，滿足不同的應(yīng)用[14,15]。當(dāng)納米材料同時(shí)兼具載體和能量受體的功能時(shí)，能更方便地將傳感器應(yīng)用于體外和體內(nèi)生物分子和生命過(guò)程的監(jiān)測(cè)和成像[5,14 - 16]；當(dāng)納米材料具備治療功能時(shí)，則能同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的成像和治療[17]，拓展了FRET熒光傳感器的應(yīng)用。相比而言，小分子構(gòu)成的FRET熒光探針一般很難進(jìn)入細(xì)胞，通常需要使用轉(zhuǎn)染試劑輔助，或者采用微注射來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用[14]。因此，納米熒光能量受體得到越來(lái)越多的關(guān)注和研究。目前受研究者們重點(diǎn)關(guān)注并已得到充分研究的納米能量受體主要有石墨烯[18,19]、氧化石墨烯[3,5]、Au納米顆粒[7,20]等。除此之外，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，一些具有類石墨烯結(jié)構(gòu)的二維納米材料，如MoS2[21]、WS2[22]，以及其它貴金屬納米材料如納米Pd[23,24]等，也具有高猝滅能力，從而構(gòu)建了一些新型的熒光傳感器。然而，如今各種納米材料層出不窮，種類繁多，哪一種才是最合適的能量受體，讓人難以抉擇。就此問(wèn)題，本文對(duì)還原型氧化石墨烯(Reduced Graphite Oxide，rGO)、氧化石墨烯(Graphite Oxide，GO)、納米二硫化鎢(WS2)、納米二硫化鉬(MoS2)、金納米粒子(Gold Nanoparticles，AuNPs)和鈀納米粒子(Palladium Nanoparticles，PdNPs)這6種納米材料進(jìn)行系統(tǒng)比較，旨在選出最優(yōu)的熒光能量受體，為FRET熒光傳感器的研究提供參考數(shù)據(jù)。

本研究選擇熒光素(FAM)作為熒光能量供體，以核酸為作用媒介，實(shí)現(xiàn)FRET并進(jìn)行研究。核酸作為研究工具具有一定優(yōu)勢(shì)。首先，核酸與6種納米材料都能相互作用[3,18,22,23,25,26]，使研究條件統(tǒng)一，消除其它影響因素；第二，核酸可通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)人為控制的雜交，獲得所需的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控供-受體距離；第三，目前核酸人工合成技術(shù)成熟，所有設(shè)計(jì)的FAM標(biāo)記和非標(biāo)記序列都可以直接采購(gòu)，方便研究的開(kāi)展。我們的研究結(jié)果表明，F(xiàn)AM標(biāo)記的單鏈核酸與納米材料相互作用都能使FAM被猝滅，但猝滅效率有所不同，其中以rGO的猝滅效率最高。進(jìn)一步的研究表明，6種納米材料中，rGO與AuNPs具有長(zhǎng)距離FRET的作用，在生物大分子熒光傳感器的構(gòu)建中具有重要意義。而且，具體的實(shí)驗(yàn)條件將影響納米材料與DNA的相互作用，從而影響FRET，故在實(shí)際應(yīng)用中需要注意控制實(shí)驗(yàn)條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

小片徑單層WS2分散液、GO溶液、小片徑單層MoS2分散液(南京先豐納米材料科技有限公司)；瓊脂糖、Green-DNA Dye核苷酸膠體染料、DNA上樣緩沖溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Au和Pd標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB04-1715-2004)(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；其它所有化學(xué)試劑均為分析純(上海麥克林生化科技有限(中國(guó)公司)。實(shí)驗(yàn)中使用的所有單鏈DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成純化，DNA序列如表1所示。不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)由表2列舉的組合雜交形成。

表1 研究中所用的DNA序列

表2 不同長(zhǎng)度的dsDNA雜交組合

1.2 儀器

Infinite M200 pro型多功能酶標(biāo)儀(瑞士，Tecan)；Tecnai G2F30透射電子顯微鏡(美國(guó)，F(xiàn)EI)；3K15冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)，Sigma)；JY600C型垂直式電泳系統(tǒng)，JY-ZY3半干式轉(zhuǎn)移電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；Tanon 1600凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；HK-9600等離子體發(fā)射光譜儀(北京華科天成科技有限公司)；Master-D超純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的瓊脂糖凝膠電泳稱取0.6 g瓊脂糖，加入15 mL緩沖溶液(0.5×TBE：0.45 mol/L Tris-H2BO3,0.01 mol/L EDTA,pH=8.0的TBE緩沖液稀釋10倍)和1 μL Green-DNA Dye核苷酸膠體染料，加熱溶解。稍微冷卻后倒模制膠。根據(jù)表2的組合制備不同長(zhǎng)度的dsDNA(1 μmol/L)，90 ℃水浴加熱5 min，冷卻后加入DNA上樣緩沖溶液，同時(shí)配制DNA Marker。上樣后在0.5×TBE緩沖溶液中，以100 V電壓電泳1 h。電泳結(jié)果在凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行熒光成像分析。

1.3.2 Au納米粒子(AuNPs)的制備與表征AuNPs的制備參考文獻(xiàn)方法[27]。用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)制備好的AuNPs形貌進(jìn)行表征。AuNPs的濃度采用發(fā)射光譜法進(jìn)行表征。往30 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯反應(yīng)釜中加入1 mL AuNPs、10 mL王水，混勻后放入微波消解爐中，按照120 ℃、150 ℃、180 ℃分別保持3 min、3 min、5 min的程序進(jìn)行消解。冷卻后轉(zhuǎn)至100 mL燒杯中，加熱至近干，再加入大約10 mL HCl(2 mol/L)繼續(xù)加熱進(jìn)行趕酸，重復(fù)3次。最后用4%HCl定容至10.00 mL，以Au標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，用發(fā)射光譜法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算AuNPs的濃度。

1.3.3 Pd納米粒子(PdNPs)的制備與表征PdNPs的制備參考文獻(xiàn)報(bào)道[28]。對(duì)PdNPs的表征與AuNPs相似，但PdNPs的濃度較低，在測(cè)定濃度前先離心進(jìn)行濃縮，以Pd標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 還原型氧化石墨烯(rGO)的制備rGO的制備參考文獻(xiàn)方法[29]。純化后將溶液轉(zhuǎn)移至干凈的已知質(zhì)量的離心管中，置于真空干燥箱中于70 ℃干燥，稱量干燥rGO固體的質(zhì)量，再用超純水配制成2 mg/mL的rGO溶液。

1.3.5 WS2/MoS2的純化將LiOH穩(wěn)定的單層WS2/MoS2分散液(1 mg/mL)超聲5 min，取10 mL分散液于透析袋中，在1 L水中透析，每4 h換1次水，換3次水，以除去溶液中多余的Li+。透析結(jié)束后收集WS2/MoS2分散液，用25.00 mL的容量瓶定容，使其濃度為400 μg/mL。

1.3.6 熒光猝滅測(cè)定按照表2的組合合成不同長(zhǎng)度的熒光DNA，將熒光DNA(30 nmol/L)與不同濃度的納米熒光能量受體混合，避光反應(yīng)10 min后，取200 μL混合溶液于96孔板中，用Infinite M200 pro酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：520 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

眾多的研究表明，納米材料與ssDNA、dsDNA的相互作用力存在差異。GO和rGO與ssDNA裸露的堿基通過(guò)π-π堆積相互作用，而金屬納米材料則通過(guò)范德華力和堿基的配位作用與ssDNA相互作用。當(dāng)DNA雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)后，堿基被磷酸骨架保護(hù)在內(nèi)，阻礙了材料與dsDNA的作用。據(jù)此，研究者們利用各種納米材料構(gòu)建了眾多的核酸傳感器[18,22,25,26]。另外，Pei等人的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ssDNA上有連續(xù)A堿基時(shí)，利用連續(xù)A堿基與AuNPs的強(qiáng)相互作用，將ssDNA用作AuNPs的穩(wěn)定配體，提高DNA功能化AuNPs的雜交效率[30]。因此，本文以FAM標(biāo)記的DNA為工具，研究不同納米材料通過(guò)與ssDNA的相互作用，與FAM發(fā)生FRET而猝滅熒光的能力(圖1a)。同時(shí)，F(xiàn)RET與熒光供-受體對(duì)之間的距離密切相關(guān)，研究中通過(guò)設(shè)計(jì)，使熒光標(biāo)記的DNA雜交形成不同長(zhǎng)度的剛性雙螺旋結(jié)構(gòu)，并在末端帶有一段能與納米材料相互作用的連續(xù)A堿基片段，從而調(diào)控?zé)晒饣鶊F(tuán)FAM與納米材料之間的距離，研究和比較不同納米材料作為熒光能量受體在不同距離下對(duì)FAM的猝滅作用(圖1b)。而當(dāng)熒光標(biāo)記的DNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，將失去與納米材料的相互作用而不發(fā)生FRET(圖1c)。

圖1 (a)ssDNA、(b)末端帶連續(xù)A堿基片段的dsDNA和(c)完全互補(bǔ)配對(duì)的dsDNA分別與不同納米材料相互作用示意圖Fig.1 Illustration of the interaction between ssDNA (a),dsDNA with unhybridized terminal single-stranded fragment (b),and completely complementary paired dsDNA (c) and different nanomaterials

2.2 材料制備與表征

研究開(kāi)展前，我們先對(duì)DNA的設(shè)計(jì)進(jìn)行了驗(yàn)證。按表2設(shè)計(jì)的序列組合雜交后，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)不同長(zhǎng)度的dsDNA進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見(jiàn)，除了L1 ssDNA不能被雙鏈特異性熒光染料SYBR Green I顯示外，不同組合雜交形成的dsDNA都顯示出了明顯的熒光條帶，表明我們的設(shè)計(jì)成功雜交形成了dsDNA。而且圖中顯示不同的dsDNA遷移率不同，表明各個(gè)組合基本按照我們的設(shè)計(jì)形成了不同長(zhǎng)度的dsDNA。但對(duì)比DNA marker，各條帶的堿基數(shù)與設(shè)計(jì)的dsDNA結(jié)構(gòu)不一致(dsDNA每10 bp約為3 nm)，可能是由于結(jié)構(gòu)中末端連續(xù)A堿基片段造成遷移率的變化。

圖2 不同結(jié)構(gòu)DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of different DNAL1:ssDNA;L2:4.5 nm;L3:10 nm;L4:15 nm;L5:20 nm;L6:30 nm;M:DNA marker.

在納米材料方面，rGO、AuNPs和PdNPs都有了較為成熟的制備方法。對(duì)于rGO，為了提高其水溶性，便于水體系的實(shí)驗(yàn)研究，我們選擇將rGO磺酸化[31]。對(duì)于AuNPs和PdNPs，我們從多種方法中選擇了檸檬酸鈉為還原劑和穩(wěn)定劑制備AuNPs[27]，以及抗壞血酸鈉為還原劑、檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑制備PdNPs的方法[28]。這兩種方法制備的都是檸檬酸鈉穩(wěn)定的球形納米溶膠，且可通過(guò)還原劑的用量在一定程度上調(diào)控納米顆粒的粒徑。透射電鏡(TEM)結(jié)果(圖3)表明，我們制備的AuNPs和PdNPs粒徑、形貌均一，粒徑都在15 nm左右，從而在一定程度上消除了金屬納米顆粒粒徑不同引起相互作用和吸光系數(shù)差異[12,24]所帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)影響。

圖3 AuNPs(a)和PdNPs(b)的透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM images of AuNPs(a) and PdNPs(b)

2.3 熒光能量受體的理論比較

FRET發(fā)生的前提是熒光能量供體的發(fā)射光譜與熒光能量受體的吸收光譜存在重疊，并且可通過(guò)光譜重疊的程度計(jì)算FRET的效率[32]。因此，我們首先對(duì)FAM的發(fā)射光譜和6種納米材料的吸收光譜進(jìn)行了分析，從理論上比較了6種納米材料對(duì)FAM的熒光猝滅(圖4)。從圖中可見(jiàn)，以FAM為熒光能量供體，與6種能量受體的吸收光譜均有重疊，表明理論上6種納米材料都能通過(guò)FRET猝滅FAM的熒光。在相同條件下，光譜重疊程度越高，則FRET效率越高，對(duì)熒光的猝滅越顯著[32]。比較圖中的重疊面積可見(jiàn)，理論上6種材料對(duì)FAM的猝滅能力大小順序?yàn)椋簉GO>PdNPs>AuNPs>WS2>GO>MoS2。根據(jù)文獻(xiàn)方法[32]對(duì)重疊面積進(jìn)行積分計(jì)算，可更明顯比較6種材料對(duì)FAM的猝滅能力(表3)。從表中可見(jiàn)，理論上6種材料的猝滅能力有很大的差異。以重疊面積為基礎(chǔ)，可進(jìn)一步計(jì)算FRET發(fā)生的距離限制——F?rster半徑。但在計(jì)算過(guò)程中，需要能量受體的摩爾消光系數(shù)(ε,單位L·mol-1·cm-1)。而在我們研究的6種納米材料中，只有AuNPs和PdNPs可計(jì)算其摩爾消光系數(shù)，其余的二維納米材料目前仍無(wú)法獲得其物質(zhì)的量濃度。因此，為統(tǒng)一比較，我們使用了材料的消光系數(shù)(k,單位L·g-1·cm-1)計(jì)算其重疊面積，無(wú)法進(jìn)一步在理論上比較各能量受體的F?rster半徑。

圖4 6種納米材料紫外可見(jiàn)吸收光譜與FAM發(fā)射光譜重疊(插圖：縱坐標(biāo)小于0.1范圍內(nèi)的局部放大圖)Fig.4 Emission spectrum of FAM and UV-vis absorption spectra of 6 nanomaterials，showing the spectral overlap integral(Inset:Y-axis amplification of the spectra in the range of 0-0.08)

表3 6種納米材料與FAM的光譜重疊面積

2.4 FAM熒光猝滅比較

在用6種納米材料做能量受體猝滅標(biāo)記在DNA上的FAM時(shí)，結(jié)果出乎意料。我們用每一種材料分別猝滅不同長(zhǎng)度的dsDNA和ssDNA，以分析各種材料在不同距離下對(duì)FAM的猝滅效果。實(shí)驗(yàn)中我們考慮到溶液體系能量受體自身內(nèi)濾作用所引起的熒光猝滅，以完全互補(bǔ)的dsDNA作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。從結(jié)果(圖5)可見(jiàn)，其中以rGO的猝滅效果最優(yōu)，只需要3 μg/mL的濃度便能猝滅ssDNA達(dá)到95%以上，其次是GO，10 μg/mL的濃度同樣能猝滅ssDNA 90%以上。PdNPs、AuNPs、WS2都能達(dá)到80%左右的猝滅率，但相對(duì)而言AuNPs用了60 μg/mL，PdNPs和WS2分別用了150 μg/mL和200 μg/mL。MoS2的猝滅效率最低，200 μg/mL只產(chǎn)生了50%的猝滅。

圖5 rGO(a)、PdNPs(b)、AuNPs(c)、WS2(d)、GO(e)和MoS2(f)在不同濃度下對(duì)不同DNA的熒光猝滅效率Fig.5 Fluorescence quenching of FAM in the presence of different concentrations of rGO(a)，PdNPs(b)，AuNPs(c)，WS2(d)，GO(e) and MoS2(f)

另一方面，F(xiàn)RET是受距離限制的，雖然我們無(wú)法從理論上計(jì)算各種材料的F?rster半徑，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以初步了解不同材料與FAM組成FRET對(duì)時(shí)的距離限制。比較每一種材料對(duì)不同長(zhǎng)度DNA的熒光猝滅率，我們發(fā)現(xiàn)，除PdNPs外的5種材料都表現(xiàn)出了距離相關(guān)的猝滅情況。WS2作為能量受體的距離要求較高，4.5 nm長(zhǎng)的雙鏈結(jié)構(gòu)已經(jīng)限制了FRET的發(fā)生，表現(xiàn)出來(lái)的熒光猝滅與完全互補(bǔ)的dsDNA一樣，即都是WS2的內(nèi)濾作用引起的猝滅。GO和MoS2的FRET距離限制與一般的有機(jī)熒光能量受體差不多，4.5 nm時(shí)還有一半左右的FRET效率，距離大于10 nm時(shí)則限制了FRET的發(fā)生。相對(duì)的，rGO和AuNPs則能發(fā)生長(zhǎng)距離的FRET，即使使用了30 nm的dsDNA，仍表現(xiàn)出比完全互補(bǔ)dsDNA更高的猝滅效率，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7,19,20]。這長(zhǎng)距離FRET已經(jīng)被研究者們用于構(gòu)建基于FRET的熒光傳感器[19,20]。

當(dāng)我們把6種納米材料對(duì)ssDNA的猝滅效率扣除由內(nèi)濾效應(yīng)引起的猝滅，便可獲到6種材料實(shí)際通過(guò)FRET猝滅FAM的能力(圖6)。由結(jié)果可知，rGO依舊是最優(yōu)的熒光能量受體，其次是GO、AuNPs、WS2和MoS2，PdNPs 在該實(shí)驗(yàn)條件下幾乎不表現(xiàn)出FRET，F(xiàn)RET效率與理論分析大相徑庭；且WS2和MoS2只有不高于30%的FRET猝滅效率，與文獻(xiàn)報(bào)道[22,25]相去甚遠(yuǎn)。這是由于不同的實(shí)驗(yàn)條件影響了納米材料與DNA相互作用，從而影響了FRET的發(fā)生。

圖6 6種納米材料對(duì)ssDNA的FRET猝滅效率比較Fig.6 Comparison of FRET-based quenching of FAM labeled on ssDNA by 6 nanomaterials。EFRET:FRET efficiencyEFRET = EssDNA-EdsDNA;EssDNA:quenching efficiency to single-stranded DNA;EdsDNA:quenching efficiency to completely complementary paired double-stranded DNA.

圖7中的結(jié)果說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)FRET的影響。從圖中可見(jiàn)，透析處理除去多余Li+的WS2和MoS2以完全互補(bǔ)的dsDNA為對(duì)照，能明顯地猝滅ssDNA。但相對(duì)的，含有大量Li+的WS2和MoS2猝滅率與完全互補(bǔ)的dsDNA一樣，完全只是由內(nèi)濾作用猝滅了ssDNA。另外，我們還設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證PdNPs與DNA之間是由于沒(méi)有相互作用而不發(fā)生FRET(圖8a)。當(dāng)DNA與PdNPs混合，若DNA與PdNPs不發(fā)生相互作用，則經(jīng)過(guò)離心后，PdNPs沉淀下來(lái)，上清液不存在PdNPs而失去內(nèi)濾作用引起的熒光猝滅，恢復(fù)了DNA上FAM的熒光；相反，若DNA與PdNPs相互作用而被吸附于PdNPs表面，則經(jīng)過(guò)離心后，被吸附的DNA與PdNPs 一同沉淀下來(lái)，上清液則由于DNA 濃度降低而熒光強(qiáng)度有所下降。據(jù)此，我們可知道DNA與PdNPs之間是否發(fā)生相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8b(上層)所示，雖然ssDNA和不同長(zhǎng)度的dsDNA與PdNP混合都會(huì)使熒光猝滅，但離心后，上清液的熒光強(qiáng)度分別恢復(fù)到了與ssDNA和dsDNA對(duì)照一致。相對(duì)的，用作對(duì)照實(shí)驗(yàn)的AuNPs離心后，上清液的熒光強(qiáng)度明顯低于ssDNA和dsDNA對(duì)照(圖8b，下層)。需要說(shuō)明的是，ssDNA和dsDNA對(duì)照的熒光強(qiáng)度差異是來(lái)自于G堿基對(duì)熒光基團(tuán)的猝滅[33,34]，雜交成雙鏈后G與C互補(bǔ)配對(duì)，削弱了G堿基對(duì)熒光基團(tuán)的各種猝滅作用[34]，從而使熒光增強(qiáng)。由結(jié)果表明，PdNPs的確沒(méi)有與DNA相互作用，而Li+使WS2/MoS2與FAM標(biāo)記的ssDNA之間失去FRET。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，我們需要注意控制實(shí)驗(yàn)條件，以確保FRET的發(fā)生，并獲得最大的FRET效率。

圖7 不同濃度的含有LiOH穩(wěn)定劑(未透析處理)與不含LiOH(透析處理)的WS2(a)和MoS2(b)對(duì)ssDNA的熒光猝滅效率。實(shí)驗(yàn)中以材料對(duì)完全互補(bǔ)的dsDNA猝滅率為參比Fig.7 Comparison of fluorescence quenching by WS2(a) and MoS2(b) with and without Li+.The quenching of complementary dsDNA was set as control

圖8 (a)驗(yàn)證DNA與納米材料相互作用示意圖;(b) 75 μg/mL PdNPs(上層)和35 μg/mL AuNPs(下層)與不同DNA混合，離心前后的熒光強(qiáng)度Fig.8 (a) Scheme of the validation of DNA-nanomaterials interactions;(b) Fluorescence intensities of the tests for 75 μg/mL PdNPs(upper) and 35 μg/mL AuNPs(lower) with different DNA

3 結(jié)論

本文以標(biāo)記在DNA上的FAM為熒光能量供體，從理論上和實(shí)驗(yàn)上比較了rGO、GO、PdNPs、AuNPs、WS2和MoS2這6種納米材料作為熒光能量受體，通過(guò)FRET猝滅FAM熒光的能力。理論上6種材料都能作為FAM的熒光能量受體，其中以rGO最優(yōu)，PdNPs次之。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，橫向比較6種材料，rGO的FRET效率最高，只需3 μg/mL的濃度可將ssDNA上的FAM猝滅達(dá)到95%，其次是GO，AuNPs，WS2和MoS2，PdNPs則由于在此研究條件下與ssDNA沒(méi)有相互作用而不表現(xiàn)出FRET猝滅。當(dāng)縱向比較同一材料對(duì)不同長(zhǎng)度DNA的猝滅時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)6種材料作為熒光能量受體所受到的距離限制不一樣，rGO和AuNPs表現(xiàn)出長(zhǎng)距離的FRET，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論相一致；GO和MoS2與其它熒光能量受體一樣，當(dāng)供-受體距離小于10 nm時(shí)才發(fā)生FRET；WS2則對(duì)距離的要求相對(duì)較高，供-受體距離為4.5 nm時(shí)已限制了FRET。另外，我們還發(fā)現(xiàn)WS2和MoS2溶液中加入LiOH做穩(wěn)定劑時(shí)，材料失去了與ssDNA的相互作用。

綜上所述，在以FAM標(biāo)記的DNA為能量供體的FRET研究中，rGO在理論上和實(shí)驗(yàn)上都是最佳的能量受體。在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)使用納米材料做熒光能量受體時(shí)要注意控制實(shí)驗(yàn)條件，這對(duì)材料與DNA的相互作用有很大影響，從而影響FRET效率。