楊 松，柏 楊，王文利，許樂園，高 云，王 苓，鄒 楠，慕 衛(wèi)*,

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018; 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心，山東泰安 271018)

代森錳鋅(Mancozeb)是乙撐雙二硫代氨基酸甲酸錳和鋅離子的配位化合物，它是一種非內(nèi)吸性廣譜保護(hù)性殺菌劑，廣泛用于防治蔬菜和果樹等作物的葉部真菌病害[1]。但該殺菌劑的主要雜質(zhì)和分解產(chǎn)物乙撐硫脲(ETU)具有致癌、致畸、致突變作用，因此其殘留問題受到廣泛關(guān)注[2]。水環(huán)境是與人類接觸較為密切的環(huán)境介質(zhì)，具有較強(qiáng)的污染物遷移能力[3]。水體中痕量代森錳鋅殘留檢測(cè)對(duì)靈敏度要求極高，然而目前水體中代森錳鋅殘留檢測(cè)方法過(guò)程繁瑣，靈敏度較低。因此，建立一種靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)水體中痕量代森錳鋅的分析方法很有必要。

目前，有關(guān)代森錳鋅的殘留分析已有很多報(bào)道，常見的檢測(cè)方法有氣相色譜法(GC)[4,5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[8]等。GC和GC-MS法是基于Keppel在1969年提出的二硫代氨基甲酸酯酸水解法[9]，測(cè)出的是所有化合物產(chǎn)生的總量，以CS2的檢測(cè)量計(jì)算，該方法目前應(yīng)用較多，但其穩(wěn)定性和靈敏度較差。HPLC和HPLC-MS/MS法則采用碘甲烷對(duì)代森錳鋅進(jìn)行柱前甲基化，測(cè)定其衍生產(chǎn)物亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯。由于該衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性好，所以此類檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性相對(duì)較好，應(yīng)用也相對(duì)較多[10]。

水體中痕量農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法一般采用固相萃取(SPE)。固相萃取具有高效、簡(jiǎn)便、快速、安全、重復(fù)性好、多倍富集和便于前處理自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[11]。Cleanrt?-PEP固相萃取柱表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán)，可廣泛應(yīng)用于各種化合物的提取、富集和凈化。本研究以Cleanrt?-PEP固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮和凈化，建立了柱前衍生化的SPE-UPLC-MS/MS法檢測(cè)水體中痕量代森錳鋅殘留。方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為水體中代森錳鋅殘留量的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC-H-Class Xevo-TQS Micor超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；YP20002天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；瓶口分液器(5～50 mL，德國(guó)Dispensette)；SC-3612離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Cleanrt?-PEP和Cleanrt?-S C18固相萃取柱(博納艾潔爾科技有限公司)；YGC-8真空固相萃取儀(鄭州寶晶電子科技有限公司)。

代森錳鋅標(biāo)準(zhǔn)品(98%，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)；碘甲烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；硫酸二甲酯(上海吉至生化科技有限公司)；NaCl(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水MgSO4(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、甲酸和甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；EDTA-2Na、NaOH(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))；L-半胱氨酸(分析純，天津市科密歐試劑有限公司)；高溫蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取67.2 g EDTA-2Na，24.3 g L-半胱氨酸和32 g NaOH，用2 000 mL水溶解定容得到溶液A(pH=9.6～10)。準(zhǔn)確稱取一定量代森錳鋅標(biāo)準(zhǔn)品，用溶液A定容得到500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，然后再分別稀釋得到10、20、50、100、500、1 000 ng/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，待衍生化處理。

1.3 樣品衍生化及凈化

準(zhǔn)確量取300 mL待測(cè)樣品于500 mL的具塞三角瓶中，加入13.4 g EDTA-2Na，7.3 g L-半胱氨酸，6.4 g NaOH和0.6 mL碘甲烷，室溫下于搖床上振蕩20 min后靜置5 min，然后采用真空固相萃取儀以2 mL/min過(guò)Cleanrt?-PEP固相萃取小柱，再以6 mL乙腈洗脫，收集洗脫液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待檢測(cè)。

1.4 分析條件

液相色譜條件：ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm 1.7 μm；美國(guó)，Waters公司)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～2 min，90%～2%A；2～3 min，2%A；3～3.01 min，2%～90%A；3.01～4.5 min，90%A。流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；總運(yùn)行時(shí)間4.5 min。

質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度550 ℃；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；錐孔反吹氣30 L/h。離子掃描模式為ESI+，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯的MRM參數(shù)見表1。

表1 亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯MRM采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

甲酸是ESI+模式下增強(qiáng)被測(cè)物質(zhì)[M+H]+離子化程度的常用試劑，同時(shí)也能使峰形更加的尖銳和對(duì)稱[12]。本文選用0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，優(yōu)化梯度洗脫條件得到MRM模式下亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯的色譜圖(圖1)，可在4.5 min內(nèi)將目標(biāo)化合物分離檢測(cè)。

圖1 亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯MRM色譜圖Fig 1 MRM chromatogram of mancozeb-dimethyl

2.2 衍生試劑的選擇及用量

目前對(duì)代森錳鋅的檢測(cè)，一種是以二硫代氨基甲酸酯酸水解法測(cè)出的是所有化合物產(chǎn)生的CS2，以其檢測(cè)量計(jì)算，該方法目前應(yīng)用較多，但其穩(wěn)定性和靈敏度較差[13]；另一方向是以碘甲烷和硫酸二甲酯作為生化試劑進(jìn)行甲酯化測(cè)定其衍生物亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯[14]。本文對(duì)碘甲烷和硫酸二甲酯衍生試劑進(jìn)行優(yōu)化選擇，固定L-半胱氨酸和EDTA-2Na的使用量，代森錳鋅與EDTA-2Na進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成代森鈉，代森鈉再與衍生試劑發(fā)生甲基化反應(yīng)，得到甲基化衍生產(chǎn)物亞乙基-1,2-雙二硫代氨基甲酸甲酯。以1 000 ng/L的代森錳鋅標(biāo)樣中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1 mL 不同體積的碘甲烷和硫酸二甲酯進(jìn)行衍生化，然后經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)，比較衍生產(chǎn)物的峰面積。由圖2可知，硫酸二甲酯在添加體積為0.4 mL時(shí)衍生產(chǎn)物的峰面積最大，用量繼續(xù)增大峰面積變化不大。碘甲烷在添加體積為0.6 mL時(shí)衍生產(chǎn)物的峰面積達(dá)到最大。因此，本研究選用碘甲烷作為衍生化試劑，并確定其使用量為0.6 mL。

圖2 不同添加量碘甲烷(a)和硫酸二甲酯(b)下衍生產(chǎn)物的峰面積Fig.2 Peak area of derivative products with iodomethane(a) and dimethyl sulfate(b)

2.3 L-半胱氨酸用量

L-半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，它是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中惟一具有還原性基團(tuán)-SH的氨基酸，試驗(yàn)條件比較溫和[15]。代森錳鋅在堿性條件下易發(fā)生分解，需要加入一定量的抗氧化劑L-半胱氨酸來(lái)避免分解。固定碘甲烷和EDTA-2Na的使用量，在L-半胱氨酸濃度50 mmoL/L、100 mmoL/L、150 mmoL/L、200 mmoL/L、250 mmoL/L和300 mmoL/L時(shí)比較衍生產(chǎn)物的峰面積(圖3)。結(jié)果表明，隨著L-半胱氨酸濃度的增加衍生產(chǎn)物的峰面積逐漸增加，在濃度200 mmoL/L時(shí)衍生產(chǎn)物的峰面積最大，因此確定L-半胱氨酸的濃度為200 mmoL/L。

圖3 不同濃度L-半胱氨酸下衍生產(chǎn)物的峰面積Fig.3 Peak area of derivative products at different concentrations of L-cysteine

2.4 固相萃取柱的選擇

以添加水平為1 000 ng/L，以上樣速度為2 mL/min過(guò)柱，考察了2種不同吸附類型的固相萃取柱Cleanrt?-PEP和Cleanrt?-S C18的富集濃縮效果。分別采用4、5、6、8和10 mL乙腈進(jìn)行洗脫，以單點(diǎn)校正方式定量分析，考察回收率情況(圖4)。結(jié)果表明，在4～10 mL洗脫液下，Cleanrt?-PEP固相萃取柱的平均回收率在60.2%～98.9%之間，當(dāng)洗脫液為6 mL時(shí)回收率達(dá)到峰值，再增加洗脫體積回收率變化不大；Cleanrt?-S C18固相萃取柱的平均回收率在64.7%～67.8%之間，回收率偏低。Cleanrt?-PEP柱的填料為官能化聚丙乙烯/二乙烯苯，表面同時(shí)具有親水性和憎水性集團(tuán)，對(duì)各類極性和非極性化合物具有較均衡的萃取效果，本研究選用Cleanrt?-PEP柱進(jìn)行固相萃取，并確定洗脫液的體積為6 mL。

圖4 不同洗脫體積Cleanrt?-PEP和Cleanrt?-S C18固相萃取柱的回收率Fig.4 Recovery of Cleanrt?-PEP and Cleanrt?-S C18 solid phase extraction columns at different elution volumes

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

以代森錳鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2：代森錳鋅在10～1 000 ng/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。以添加回收最低濃度10 ng/L作為定量限(LOQ)。王珺[16]報(bào)道的氣相色譜-電子捕獲法測(cè)定環(huán)境水樣中的代森錳鋅，方法檢出限為125 mg/L。本研究與其相比靈敏度大幅度提高，能滿足水體中超痕量代森錳鋅檢測(cè)。

表2 代森錳鋅的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)和定量限

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

以LOQ作為添加回收最低濃度，歐洲共同體理事會(huì)官方公報(bào)指令中規(guī)定農(nóng)藥在水體中的最大殘留限量(MRL)值為100 ng/L[17]，以100 ng/L為添加回收中間濃度，選擇10倍MRL值作為添加回收最高濃度。分別向空白地表水水樣中添加10 ng/L、100 ng/L和1 000 ng/L三個(gè)濃度水平，每個(gè)添加水平重復(fù)處理5次，計(jì)算平均添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs%)(表3)。結(jié)果表明：代森錳鋅在水體中平均添加回收率在79.2%～101.5%之間，RSDs在2.1%～6.9%之間，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)規(guī)定要求[18]。

表3 代森錳鋅在地表水中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采集泰安周邊地區(qū)7條河流和3座水庫(kù)水樣，編號(hào)分別為SXH、PH、NH、WH、QLH、MTH、SLH和DHSK、HQSK、SLSK。WH和SLSK采集位點(diǎn)水樣檢測(cè)出代森錳鋅，濃度分別為22 ng/L和36 ng/L且低于歐盟殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其他采集位點(diǎn)均未檢出。WH和SLSK采集位點(diǎn)水樣檢出痕量代森錳鋅殘留，判斷該采集位點(diǎn)于鄉(xiāng)鎮(zhèn)周圍，附近緊鄰蔬菜基地和果園，是由于當(dāng)?shù)剞r(nóng)民施藥造成的。

3 結(jié)論

建立了柱前衍生化的SPE-UPLC-MS/MS檢測(cè)水體中痕量代森錳鋅殘留的分析方法，并優(yōu)化選擇衍生試劑及其用量。該方法具有操作簡(jiǎn)便、凈化效果好、回收率高、穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于水體中代森錳鋅殘留的檢測(cè)，可為水體中EBDCs類農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供重要借鑒。