劉冰山， 阮昆鵬， 張登峰， 武豪杰， 趙清

河南大學(xué)淮河醫(yī)院 1骨科關(guān)節(jié)科， 2風(fēng)濕免疫科(河南開(kāi)封 475000)

作為臨床的一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，風(fēng)濕性滑膜炎多發(fā)于膝關(guān)節(jié)部位，可累及全身，其發(fā)病原因仍未完全闡明，且不能治愈，仍是目前臨床治療的難點(diǎn)。在風(fēng)濕性滑膜炎發(fā)作期，可出現(xiàn)多關(guān)節(jié)腫痛，包括手、髖、膝關(guān)節(jié)等，若病情未能得以有效控制則會(huì)造成遷延不愈，導(dǎo)致病變關(guān)節(jié)病損，引起關(guān)節(jié)功能障礙。所以，及時(shí)進(jìn)行有效治療和干預(yù)，盡早控制病變關(guān)節(jié)的炎癥狀態(tài)顯得尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程和發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，也是治療該病的重要靶點(diǎn)[1]。另有研究指出，TNF-α抑制劑具有下調(diào)TNF-α表達(dá)和減緩炎性反應(yīng)進(jìn)展的作用[2]。氧化應(yīng)激不僅是風(fēng)濕性滑膜炎的一種主要誘因，而且是該病發(fā)生的一種病理結(jié)果?；诩韧訲NF-α抑制劑為代表的生物制劑成為治療多種自身免疫性疾病(如強(qiáng)直性脊柱炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)的熱點(diǎn)，我們于2017年6月至2018年12月開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，旨在分析TNF-α抑制劑對(duì)膝關(guān)節(jié)類(lèi)風(fēng)濕性滑膜炎大鼠氧化應(yīng)激抑制作用及下游信號(hào)通路的影響，從而為探究TNF-α抑制劑在風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取36只健康雄性成年SD大鼠，8～10周齡，體重180～220 g，均由廣州吉妮歐生物科技有限公司提供。在無(wú)菌環(huán)境下，于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在22～26℃，相對(duì)濕度55%～65%，可自由進(jìn)食、飲水，給予充足光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組 在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組各12只。其中，對(duì)照組為正常大鼠，未進(jìn)行任何用藥；模型組和干預(yù)組均采用風(fēng)(風(fēng)速4～5 m/s)、寒(室內(nèi)溫度7～9℃)、濕(相對(duì)濕度80%～90%)的環(huán)境因素聯(lián)合膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.5%木瓜蛋白酶(南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司)0.30 mL+0.03 mol/L半胱氨酸蛋白酶(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)0.20 mL制備風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠模型；模型組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水，干預(yù)組經(jīng)尾靜脈注射TNF-α抑制劑阿達(dá)木單抗(英國(guó)AbbVie Ltd.公司)0.50 mg/kg。

1.2.2 外周血細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 造模后4周，于大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的戊巴比妥鈉進(jìn)行常規(guī)麻醉，腹主動(dòng)脈采血2 mL，以3 000 r/min離心10 min，取血清標(biāo)本置于-80℃冰箱中冷凍保存。采用酶聯(lián)吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)，速率散射比濁法檢測(cè)大鼠血清C反應(yīng)蛋白，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；亞硝酸還原法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)谷胱甘肽和丙二醛，試劑盒購(gòu)自浙江邁康生物工程有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)指示完成檢測(cè)。

1.2.3 膝關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查 取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，置于4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟，行蘇木精-伊紅染色(染色液購(gòu)自上?；鶢栴D生物科技有限公司)，并于顯微鏡(日本Olympus公司)下進(jìn)行觀察。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α轉(zhuǎn)換酶(TNF-α converting enzyme，TACE)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)蛋白表達(dá)。取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨滑膜組織，經(jīng)液氮進(jìn)行研磨，加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解；離心，取上清液，加入十二烷基硫酸鈉緩沖液充分混勻；提取總蛋白，勻漿，檢測(cè)蛋白含量；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉。以β-actin為內(nèi)參照，加入β-actin、TACE、NF-κB一抗(美國(guó)CST公司)，于4℃孵育并過(guò)夜；次日，加入經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(英國(guó)Abcam公司)，于37℃溫度下反應(yīng)30 min，洗膜，對(duì)目的條帶的吸光度值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠膝關(guān)節(jié)病理學(xué)觀察 3組大鼠造模成功，期間無(wú)大鼠死亡的情況。對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜無(wú)新生血管形成，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜層較??；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中可見(jiàn)明顯增多的炎性細(xì)胞，并且新生血管形成，滑膜層增厚明顯；干預(yù)組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中出現(xiàn)少量新生血管，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示本實(shí)驗(yàn)成功建立風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠模型。見(jiàn)圖1。

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：干預(yù)組

2.2 3組大鼠血清細(xì)胞因子水平的比較 相比對(duì)照組，模型組和干預(yù)組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9及C反應(yīng)蛋白含量均明顯升高(P<0.05)，且干預(yù)組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9及C反應(yīng)蛋白含量較模型組均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠血清細(xì)胞因子水平的比較

2.3 3組大鼠外周血氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 模型組和干預(yù)組血清丙二醛含量較對(duì)照組均明顯升高，谷胱甘肽和SOD的水平較對(duì)照組均明顯降低(P<0.05)；相比模型組，干預(yù)組血清丙二醛的水平顯著降低，谷胱甘肽和SOD含量均明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠外周血氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

2.4 3組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TACE和NF-κB蛋白表達(dá)的比較 模型組、干預(yù)組膝關(guān)節(jié)滑膜組織TACE和NF-κB蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯上調(diào)(P<0.05)，干預(yù)組TACE和NF-κB蛋白表達(dá)較模型組均明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

表3 3組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TACE和NF-κB蛋白表達(dá)的比較

圖2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TACE和NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè)(Western blot法)

3 討論

風(fēng)濕性滑膜炎是臨床常見(jiàn)的一種風(fēng)濕病，具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，但可能與自身免疫系統(tǒng)相關(guān)性疾病密切相關(guān)。采用膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物的方式制備膝關(guān)節(jié)滑膜炎動(dòng)物模型，具有操作簡(jiǎn)單方便、造模成功率高等優(yōu)勢(shì)。國(guó)外研究報(bào)道，于大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶聯(lián)合半胱氨酸蛋白酶的方法誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)滑膜炎模型，結(jié)果顯示造模1周內(nèi)大鼠關(guān)節(jié)明顯腫脹，且持續(xù)加重至第24天，經(jīng)病理學(xué)檢查提示滑膜炎[3]。為此，本實(shí)驗(yàn)采用風(fēng)、寒、濕環(huán)境因素聯(lián)合木瓜蛋白酶+半胱氨酸蛋白酶的方式制備風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠模型。

在風(fēng)濕性滑膜炎中，因炎癥反應(yīng)的發(fā)生而刺激膝關(guān)節(jié)滑膜組織，使得分泌液異常，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞異常增生，出現(xiàn)大量滑液，而滑液中含IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎癥細(xì)胞因子和血漿、吞噬細(xì)胞、白細(xì)胞等，大量分布于外周血和關(guān)節(jié)腔中[4-5]。另外，滑膜細(xì)胞的異常增生、骨破壞、類(lèi)腫瘤樣生長(zhǎng)等與炎性細(xì)胞因子及其炎癥信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。作為一種具有多種生物活性的促炎因子，TNF-α是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要細(xì)胞因子，可促使炎癥細(xì)胞活化，誘導(dǎo)黏附分子和趨化因子的分泌[6]。在風(fēng)濕性滑膜炎發(fā)生和發(fā)展的病理過(guò)程中，TNF-α作為一種重要的炎性反應(yīng)因子起到重要的作用。IL-1、IL-6及TNF-α均是參與膝關(guān)節(jié)退變的主要炎癥介質(zhì)，其中IL-1與TNF-α均可作用于成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷[7]；而IL-6既可誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖及活化，亦可有效調(diào)節(jié)急性期C反應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[8]。此外，IL-1與IL-6等炎癥細(xì)胞因子可通過(guò)相互作用，形成惡性循環(huán)，造成關(guān)節(jié)損傷進(jìn)一步加重。IL-1β與TNF-α等促炎細(xì)胞因子是引起類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜炎的“中心罪犯”，可通過(guò)協(xié)同誘導(dǎo)該病血管翳增生，導(dǎo)致滑膜后期骨破壞的發(fā)生[9]。國(guó)內(nèi)研究指出，IL-1、IL-6、TNF-α在膝關(guān)節(jié)類(lèi)風(fēng)濕性滑膜炎患者血清中的水平均明顯升高，控制機(jī)體炎癥狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)外周血IL-1、IL-6、TNF-α含量可作為評(píng)價(jià)風(fēng)濕性滑膜炎患者炎癥狀態(tài)和治療效果的重要指標(biāo)[10]。C反應(yīng)蛋白在健康人群血清中的濃度較低，但在機(jī)體出現(xiàn)創(chuàng)傷、急性炎性反應(yīng)等情況時(shí)的水平明顯升高[11-12]。MMP-9是MMPs家族的主要成員之一，其在降解關(guān)節(jié)軟骨中起到重要作用，可與基質(zhì)金屬蛋白抑制物相互平衡而維持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性。但在膝關(guān)節(jié)滑膜炎等病理情況下，MMP-9可導(dǎo)致軟骨基質(zhì)損傷，使得軟骨組織膠原暴露，膠原形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受破壞，導(dǎo)致軟骨損傷[13-14]。阿達(dá)木單抗是一種靶向TNF-α的全人源重組單克隆抗體，具有高親和力，可特異性地結(jié)合TNF-α，抑制其與細(xì)胞表面TNF-α受體結(jié)合，降低TNF-α水平，可起到拮抗TNF-α生物活性的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，模型組和干預(yù)組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9及C反應(yīng)蛋白均明顯升高，且干預(yù)組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9及C反應(yīng)蛋白較模型組均明顯降低。結(jié)果表明，采用TNF-α抑制劑(阿達(dá)木單抗)干預(yù)可有效減輕風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠炎癥狀態(tài)，從而可減輕膝關(guān)節(jié)損傷。

機(jī)體氧化應(yīng)激的發(fā)生可促使中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，進(jìn)而大量生成活性氧簇和活性氮簇自由基，而大量自由基可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)多種分子的氧化損傷、硝化損傷，這與風(fēng)濕性滑膜炎等多種炎癥性疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系[16]。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組和干預(yù)組血清丙二醛含量較對(duì)照組均明顯升高，谷胱甘肽和SOD的水平較對(duì)照組均明顯降低；相比模型組，干預(yù)組血清丙二醛的水平顯著降低，谷胱甘肽和SOD含量均明顯升高。結(jié)果表明，采用TNF-α抑制劑干預(yù)具有抑制風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的效果，減輕大鼠機(jī)體應(yīng)激損傷，提示TNF-α抑制劑具有抗氧化應(yīng)激的作用。結(jié)果表明，采用TNF-α抑制劑可有效抑制風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠氧化應(yīng)激，減輕大鼠氧化應(yīng)激損傷，其原因可能因TNF-α抑制劑具有清除羥自由基和氧自由基作用，促使TNF-α和丙二醛含量減少，GSH-Px和SOD活性提高，阻滯IL-1β過(guò)度分泌，因而具有抗氧化損傷的功能。

TACE具有調(diào)控內(nèi)毒素誘導(dǎo)下TNF-α酶解的作用，可作為炎癥性疾病的一種潛在治療靶點(diǎn)。作為一種參與多種炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，NF-κB在促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、刺激炎癥因子的生成、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)等方面發(fā)揮著重要的作用[17]。并且，NF-κB是核內(nèi)炎性轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員之一，具有調(diào)控TNF-α表達(dá)的作用，可調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)和炎癥反應(yīng)。TNF-α刺激滑膜細(xì)胞后，NF-κB在胞質(zhì)中的表達(dá)下調(diào)，在細(xì)胞核中的表達(dá)上調(diào)，TNF-α可促使NF-κB信號(hào)通路活化，而使之發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過(guò)程中多種細(xì)胞黏附因子和促炎因子表達(dá)的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Western blot法檢測(cè)可知，模型組、干預(yù)組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TACE和NF-κB蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯上調(diào)，干預(yù)組TACE和NF-κB蛋白表達(dá)較模型組均明顯下調(diào)。結(jié)果表明，采用TNF-α抑制劑干預(yù)可有效下調(diào)風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠TACE和NF-κB蛋白表達(dá)水平，抑制其過(guò)度表達(dá)，降低NF-κB活性，從而可有效阻滯TACE/NF-κB信號(hào)通路異?；罨?，抑制下游IL-1β、IL-6等多種炎癥因子的釋放，減輕炎癥程度，由此推測(cè)這可能是TNF-α抑制劑改善大鼠風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎的一種作用機(jī)制。

綜上所述，采用TNF-α抑制劑可有效減輕風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎大鼠氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)，緩解膝關(guān)節(jié)損傷程度，下調(diào)TACE和NF-κB蛋白表達(dá)，其作用機(jī)制可能與TNF-α抑制劑可通過(guò)阻滯TACE/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮減輕大鼠風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎的作用密切相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)尚處于初步研究階段，且有關(guān)TNF-α抑制劑對(duì)風(fēng)濕性膝關(guān)節(jié)滑膜炎的具體作用機(jī)制目前尚未完全明確，且動(dòng)物模型與人體內(nèi)環(huán)境存在明顯不同，因此今后需進(jìn)一步分析以深入探究。