石從廣，周 琦，柳新紅，李因剛，楊少宗，蔣冬月，沈 鑫，李海波

（浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

銀杏Ginkgo biloba具有適應性強、枝繁葉茂、雄偉挺拔、姿態(tài)優(yōu)美等特點，為理想的園林綠化樹種和觀賞樹種，世界上許多國家已把銀杏作為庭蔭樹、行道樹和觀賞樹廣泛栽植，或制作成觀葉和觀實盆景[1]。銀杏為雌雄異株，鑒于作為綠化的銀杏雌株結實多，果實成熟時漿果掉落對地面造成污染，為了解銀杏雌株結實機制，合理調控銀杏雌株結實，有必要開展外源植物激素調控銀杏雌株結實的內在機制及其應用研究。

關于木本植物花芽分化時期內源激素的動態(tài)變化研究表明，高水平的GAs（赤霉素）和ZT（玉米素）有利于麻風樹Jatropha curcas雌雄花器官的發(fā)育；高水平的ZT含量，ABA/IAA（脫落酸/生長素），ABA/GA，ZT/GA利于文冠果Xanthoceras sorbifolium花芽的分化[2-3]。對銀杏花芽分化過程中內源激素的變化規(guī)律研究表明，內源激素ABA，ZT和iPAs（異戊烯腺嘌呤類）與銀杏雌花芽的誘導及分化密切相關[4-5]。

關于外源激素調控植物花芽分化的研究目前已在龍眼Dimocarpus longana[6]，蘋果Malus pumila[7-8]，無花果Ficus carica[9]和鼠耳芥Arabidopsis thaliana[10-11]上有相關報道。這些研究表明，外源激素通過影響內源激素的比例從而影響植物的花芽分化，高含量的GAs和ABA不利于花芽分化，而高含量的CTK（細胞分裂素）則有利于花芽分化；噴施GAs能抑制花芽分化和雌花芽成花；但對鼠耳芥GA缺陷型和敏感型突變體的研究表明，GA合成和信號傳導在花朵開放的過程中起到至關重要的作用，GA合成突變體ga1表現(xiàn)出了明顯的花期推遲現(xiàn)象。

要闡明植物外源激素如何影響銀杏開花，就必須從分子水平上對銀杏開花的內在調控機制作深入探究。植物開花過程由內源因子和外源因素共同決定，植物開花（自主促進途徑）所需的必要條件，主要涉及調控植物開花轉換的相關基因。LFY（LEAFY）是目前研究得最清楚的與開花相關的轉錄因子[12-14]。與被子植物不同，銀杏具有雙拷貝的LFY同源基因[15]，由于銀杏是雌雄異株植物，其中一個LFY同源基因GinLFY在雌雄株上的序列也不盡相同，銀杏雄株與雌株的GinLFY基因核苷酸序列同源性高達99%[16]，銀杏兩個LFY同源基因GinLFY和GinNdly在其生長發(fā)育過程中有著截然不同的表達方式，GinLFY為組成型表達，而GinNdly屬于組織特異性表達[17]。這種時空表達差異可能是裸子植物花進化發(fā)育的一個顯著特征，也可能是造成銀杏童期長的一個重要因素[18]。AG（AGAMOUS）基因是植物花器官特異性基因，決定雌蕊、雄蕊的分化和形成。從銀杏基因組中分離得到的AG同源基因GBM5為單拷貝，除了在生殖器官雄蕊、胚珠以及雌配子體有表達之外，在雌雄株的幼葉中也有表達[19]。

國內對于銀杏雌雄株花芽的形態(tài)分化已有報道[20-21]，也有基于轉錄組測序的銀杏花芽分化時期相關基因篩選與表達分析的研究，并對篩選出的與開花調控相關的GbCOL基因進行生物信息學分析，推測其可能在銀杏開花調控過程中發(fā)揮重要作用[22-24]。但從分子水平上研究外源激素如何通過影響開花相關基因的表達從而調控銀杏開花的機制，迄今尚未見報道。

銀杏是裸子植物，其調控開花的相關基因不能套用ABC模型，本文根據已報道的銀杏開花相關基因GinLFY，GinNdly和GBM5的序列，設計合適的引物，利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）手段來檢測這些基因在不同外源激素處理間轉錄水平的差異。基于對組織特異性表達的基因進行相對定量表達的嘗試在取樣上比較困難，很少有公開報導，本研究嘗試在銀杏花芽分化始期施加外源激素GA3與PP333，探討外源激素如何通過影響銀杏開花相關基因的表達來抑制或促進銀杏的開花結實，為揭示外源激素調控銀杏花芽分化的分子機制提供另外一種研究視角。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在浙江省長興縣名圃苗木場（以下簡稱苗木場）選取15株已結實的10年生銀杏雌樹，于每年休眠期和開花期各施用有機肥（羊糞）一次，每株每次施有機肥2 kg，正常的除草管理。

外源激素GA3為赤霉素粉末狀結晶，PP333為50%多效唑可濕性粉劑，使用前分別溶解成1 g·L-1和 0.5 g·L-1的原液，4℃冷藏備用，噴施時稀釋成不同濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

RNA提?。篢aKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa Code.9769)試劑盒；DNA消除：PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒；RT反應和PCR反應：5×PrimerScript Buffer (for Real Time)，SYBR Premix Ex Taq II (2×)。

1.2 儀器與設備

沃傲麒3 m金屬頭高枝剪，安勝達園林公司；雙肩背負高壓噴霧器16 L型，沃施（Worth）園藝；StepOne型熒光定量PCR儀，Applied Biosystems公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 噴施外源激素和統(tǒng)計開花結實的表型指標 2018年4月初，在苗木場將選取的15株銀杏雌株進行分組編號，每5株為一組，從每組中分別隨機選取3株作為樣株（分別編號為1-1，1-2，1-3；2-1，2-2，2-3；CK-1，CK-2，CK-3），在每株樣株上用高枝剪剪取5～ 10個結果枝（用標簽進行編號），用來統(tǒng)計開始綻放的花芽和葉芽數(shù)目，統(tǒng)計后用軟尺測量結果枝長度，計算單位長度（每米）銀杏結果枝上的雌花芽數(shù)（number of flower bud per meter，NFB）和葉芽數(shù)（number of leaf bud per meter，NLB）以及兩者的比值（ratio of flower bud to leaf bud，RFL）；每米結果枝芽頭數(shù)（number of bud per meter，NB）是NFB和NLB之和，每米結果枝平均芽頭數(shù)（average number of bud per meter，ANB）為每處理3個重復的平均值，同理可以推斷每米結果枝平均花芽數(shù)（average number of flower bud per meter，ANFB）和每米結果枝平均葉芽數(shù)（average number of leaf bud per meter，ANLB）。然后在銀杏花芽分化始期（6月）用高壓噴霧器分別噴施200 mg·L-1GA3（1-1，1-2，1-3），100 mg·L-1PP333（2-1，2-2，2-3）和清水（CK-1，CK-2，CK-3），每間隔7～ 10 d噴施一次，共噴施3次。

2019年4月初，以同樣的方式剪取銀杏結果枝，統(tǒng)計開始綻放的花芽和葉芽數(shù)，并采集葉芽和花芽，將每個單株上采集的花芽和葉芽混合后作為一個樣品，每個處理3個單株即3個樣品（重復），放入錫箔紙中包裹起來，在錫箔紙上用記號筆填寫對應編號然后投入干冰盒中，用作后續(xù)的RNA提取和反轉錄以及RT-qPCR試驗材料。如上再一次統(tǒng)計綻放的花芽和葉芽數(shù)，測量結果枝長度，計算ANB，ANFB，ANLB和RFL等指標。

1.3.2 RNA提取和RT-qPCR試驗 以采集到的3個處理的9個花芽、葉芽混合樣品為材料，用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa Code.9769) 試劑盒提取各個樣品的RNA，經DNA消除酶試劑盒PrimeScript RT reAGent Kit with gDNA Eraser純化后再進行RT反應，基因組DNA去除反應體系包含5×gDNA Eraser Buffer 2 mL，gDNA Eraser 1 mL，Total RNA (50 ng·mL-1) 2 mL，RNase Free ddH2O 5 mL，共計10 mL；42℃處理2 min。RT反應體系包含上述反應液10 mL，5×PrimerScript Buffer (for Real Time) 4 mL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 mL，RT Primer mix 1 mL，RNase Free ddH2O 4 mL，37℃保持15 min，然后85℃保持5 s。

根據已報道的銀杏開花相關基因GinLFY，GinNdly和GBM5的序列，參照RT-qPCR引物設計原則，利用在線網址http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm設計各候選基因的RT-qPCR引物（表1）。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司 (Dalian Takara Biotechnology Co.,Ltd.) 合成，以GAPDH為內參基因[25]，采用Step One（ABI）進行RT-qPCR反應，用2-△△CT法對這些差異表達基因的表達水平進行均一化處理[26]，通過內參基因的校正，對樣品中目的基因mRNA表達量進行分析。

PCR反應體系為25 μL（RR820反應體系），包括SYBR Premix Ex Taq II (2×)12.5 mL，Primer F/R（10 μmol·L-1）各1 mL，RT產物2 mL，ddH2O 8.5 mL。反應程序為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，各引物退火溫度30 s，40 Cycles。擴增完畢后，溫度以每0.5℃·10 s-1的速率從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲得溶解曲線。在每個反應過程中，每個內參基因的RT-qPCR均設置陰性對照，以檢驗該基因擴增反應的背景，每份樣品設置2個平行樣。

表1 定量PCR引物序列和對應的擴增片段Table 1 Sequences and corresponding amplified fragment of quantitative PCR primers

1.3.3 數(shù)據分析 利用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法分析GA3和PP333處理對銀杏雌株花芽分化的影響，采用最小顯著差異法（LSD）分析各處理間和各年份間的差異顯著性，并用Excel作圖；采用Pearson單變量Bivariate correlations方法，對GinLFY，GinNdly和GBM5基因的表達量與結果枝花芽葉芽數(shù)量性狀進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 噴施外源激素對銀杏雌株每米結果枝花芽和葉芽數(shù)的影響

對不同處理和不同年份的各花芽葉芽指標的平均值進行方差顯著性分析經，結果見表2。由表2可知，RFL和ANB在不同處理和不同年份間均無顯著性差異，但ANFB在不同處理和不同年份間存在顯著差異，其中GA3處理的ANFB顯著高于PP333處理和CK，但GA3處理中2019年的ANFB略低于2018年的，且兩者間存在顯著差異，說明施用GA3后，銀杏雌株結實勢頭有所抑制；PP333處理中2019年的ANFB顯著高于2018年，兩者間存在顯著差異，說明施用PP333后能適當促進銀杏雌株結實；CK處理中2019年的ANFB與2018年的基本持平，兩者間不存在顯著差異。ANLB在不同處理和不同年份間也存在顯著差異，但在GA3處理和PP333處理中，不同年份間卻不存在顯著差異，說明噴施外源激素對銀杏葉芽的形成沒有明顯的影響。

表2 2018年和2019年結果枝平均花芽和葉芽數(shù)統(tǒng)計分析Table 2 Analysis of ANFB and ANLB on fruit-bearing branches in 2018 and 2019

2.2 RNA提取與引物驗證結果

由圖1可知，除了引物AF108228.1-1的擴增條帶稍顯暗淡且擴增產物片段長度小于100 bp，其余3對引物的擴增條帶單一且明亮，擴增產物片段長度都在100～ 200 bp之間，其中引物GAPDH的擴增片段最長，預測在180 bp左右，引物AF10511.1-1和AY114304.1-2的擴增片段長度目測在150 bp左右，符合表1引物設定時各引物對應的預測產物片段大小。由圖1的結果說明，設定的引物都能擴增到特異且單一的條帶，擴增出的片段長度與預期的相符合，所設定的4對引物適用于RT-qPCR試驗。

圖1 4對定量引物的PCR擴增電泳圖Figure 1 PCR amplification electrophoresis of 4 pairs of quantitative PCR primers

圖2 內參基因GAPDH 在9個銀杏雌株混合芽樣本中的RT-qPCR表達量Figure 2 Expression quantity of internal reference gene GAPDH in mixed buds of 9 female G.biloba trees

2.3 GinLFY，GinNdly 和GBM5 基因在9個銀杏雌株混合花芽中的表達情況

內參基因GAPDH在9個銀杏雌株混合芽中的表達量（即ΔΔCT Rel.Qty（SDM）值，以下簡稱ΔΔCT）見圖2。由圖可知，內參基因在各處理與各樣品間的表達較為穩(wěn)定，表達量水平均在1.0左右，各單株之間的表達量均無顯著差異（P＜0.05），符合作為檢測基因參照物的條件。

圖3 3個銀杏開花相關基因在9個銀杏雌株混合芽中的相對表達量Figure 3 Relative expression of 3 flowering related genes of G.biloba in mixed buds of 9 female trees

由圖3A可知，GinNdly基因在9個銀杏雌株混合芽樣品中的表達量比較平穩(wěn)，噴施GA3和PP333二種外源激素后GinNdly基因的表達量與對照相比均無顯著差異（表3），表明激素處理對銀杏雌株混合芽GinNdly因的表達沒有明顯的誘導作用。不同的是，GinLFY基因和GBM5基因在二種激素處理后總體上皆呈上調表達（圖3B-C）。方差顯著性分析（表3）顯示，對于GinLFY基因，對照的ΔΔCT平均值為0.208±0.231，顯著低于GA3處理的1.579±0.645（P＜0.05），也低于PP333處理的1.130±0.748；對于GBM5基因，對照的ΔΔCT平均值為0.003±0.003，顯著低于GA3處理的2.714±2.181（P＜0.05）和PP333處理的1.654±2.862（P＜0.05）。這表明二種激素處理對于銀杏雌株混合芽GinLFY和GBM5基因的表達具有顯著的誘導上調作用。

表3 各處理對應的3個基因的相對表達量的差異分析Table 3 ANOVA on relative expression of the 3 genes corresponding to each treatment

2.4 基因相對表達量與結果枝花芽葉芽數(shù)量性狀的相關性

采用Bivariate correlations方法，對GinLFY，GinNdly和GBM5基因的表達量與2019年9個單株結果枝的花芽、葉芽數(shù)進行相關分析，結果見表4。由表4可知，RFL與NFB之間呈極顯著正相關，其Pearson相關系數(shù)為0.948，與NLB間呈極顯著負相關，其Pearson相關系數(shù)為-0.826；此外，NFB與NLB之間呈極顯著負相關，其Pearson相關系數(shù)為-0.833，說明在一定長度的結果枝內，花芽數(shù)越多葉芽數(shù)相應越少，基因AF108228.1（GinLFY）和AY114304.1（GBM5）的相對表達量與平均花芽數(shù)呈一定的正相關（Pearson相關系數(shù)分別為0.348和0.481），而基因AF105111.1（GinNdly）的相對表達量與平均花芽數(shù)呈一定的負相關（Pearson相關系數(shù)為-0.590），但相關性均不顯著；基因AF108228.1（GinLFY）與AY114304.1（GBM5）的相對表達量呈顯著的正相關關系（Pearson相關系數(shù)0.746），說明兩個基因的表達具有較高的同步性。

表4 基因相對表達量與結果枝花芽和葉芽性狀的相關性Table 4 Correlation between relative gene expression and the traits of flower and leaf buds on bearing shoots

3 討論

Thomas等[12]在研究植物開花控制的分子和遺傳機制時對這些開花相關基因的功能進行了驗證和歸類，發(fā)現(xiàn)LFY基因的功能主要是作為一個開花開關決定著花分生組織的分化；Dilusha等[14]指出LFY的下游直接靶基因是花器官特異基因AP1和CAL，在植物開花的起始階段起著重要作用，作為一個開花轉換開關，決定花序分生組織向花分生組織的轉換。本研究結果表明，外源激素處理對銀杏雌株混合芽GinNdly基因的表達沒有明顯的誘導作用，而對GinLFY基因的表達有顯著的誘導上調作用，說明GinLFY基因與銀杏雌株的開花密切相關，但郭長祿等[17]的研究結果顯示GinLFY為組成型表達，而GinNdly屬于組織特異性表達，相較而言，組織特異性表達的GinNdly基因對外源激素的響應較為敏感，這與本文的結果有所不同，可能的原因是取樣不完整，再加上每次逆轉錄和擴增的效率不盡相同，所以導致處理間各單株的相對表達量誤差比較大。

已有研究表明AP1，AP2，AP3，AG等都是花器官特異性基因[12]，控制著花各部分組織的發(fā)育和形成，GBM5是銀杏基因組中分離得到的AG同源基因[19]，故GBM5基因很有可能決定銀杏雌蕊/雄蕊的分化和形成，這與本文的推論即GBM5基因是影響銀杏雌株開花結實的主要因子基本相吻合。近年來，在花器官發(fā)育過程中具有重要作用的MADS-box轉錄因子基因家族成員也相繼從銀杏中克隆，包括隸屬AG的GbMADS2基因[28]，有望調控開花周期和促進抗逆境脅迫的GbMADS9基因[29]，GbSEP基因[30]。此外，最近從銀杏克隆的開花基因FRIGIDA（GbFRI）可調控MADS-box轉錄因子FLC（Flowering Locus C.）基因的功能，F(xiàn)LC可阻遏銀杏開花進而導致開花推遲，是調節(jié)開花周期的主要抑制因子。因此FRIGIDA基因的克隆為銀杏春化途徑的深入研究奠定了基礎[31]。這些從銀杏中新克隆的開花相關基因也為進一步深入研究外源激素如何調控銀杏開花的分子機理拓展了思路。

總之，本研究為揭示外源激素如何影響開花相關基因表達從而調控銀杏花芽分化的分子機制提供了間接的視角，如果把噴施外源激素GA3可以抑制銀杏雌株開花的結論應用到生產實際中，則能大大減少人工疏果成本，提高種植銀杏雌株成年雌株的經濟效益。

限于客觀條件，本研究僅在某個時間點對9個銀杏單株的花葉混合芽進行了3個開花相關基因的定量表達分析，并與當年開花結實的表型性狀進行了相關分析，沒有測定噴施外源激素前后結果枝內源激素比例的變化，也沒有進行多年的觀察統(tǒng)計和取樣，這是本研究的不足之處，對外源激素調控銀杏雌株開花結實的分子機理的研究還需進一步從外源激素噴施前后結果枝內源激素比例變化和基因表達變化等方面加以深入。

4 結論

外源激素調控銀杏雌株開花結實的分子機理大致可總結為：花發(fā)育相關基因構成一個復雜的網絡共同調控銀杏開花；外源激素通過打破內源激素平衡來調控，調控過程涉及到許多上下游基因的表達。本研究表明上游開花相關基因GinLFY基因的表達水平與平均花芽數(shù)呈一定的正相關，在施用外源激素處理組（GA3和PP333）后呈上調表達，說明GinLFY基因與銀杏雌株的開花密切相關且對外源激素的響應較為敏感，很可能是調控銀杏雌株開花結實的外圍因子。下游開花基因GBM5基因的表達水平與平均花芽數(shù)呈正相關，在施用外源激素后呈上調表達，且與GinLFY基因的表達具有較高的同步性。據此推斷，上游開花相關基因GinLFY表達的上調和下調決定GBM5基因的相對表達，從而影響銀杏的開花結實。