截葉鐵掃帚中蘆丁、槲皮素與山奈酚含量測(cè)定研究

董洪強(qiáng)，趙躍麗，張?zhí)m勝,2*

(1.大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.麗江師范高等?？茖W(xué) 校應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，云南 麗江 674199)

截葉鐵掃帚(Lespedezacuneata(Dum. Cours.) G. Don)為豆科胡枝子屬一年生草本植物，又名夜關(guān)門、千里光等，廣泛分布于我國(guó)大部分省份，山坡、曠野地均有生長(zhǎng)，全草入藥。截葉鐵掃帚在我國(guó)有著悠久的用藥歷史，《滇南本草》中就有記載，具有止咳平喘、清熱利濕等功效，常用于治療慢性氣管炎、疳積、糖尿病、脾虛腹瀉及脫肛等疾病[1-2]。以截葉鐵掃帚為主要原料的貴州董酒系列產(chǎn)品等，一直得到消費(fèi)者的青睞[3]。截葉鐵掃帚的化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要為黃酮類、酚酸類、木脂素類等[4-7]。黃酮類化合物在植物界中分布廣泛，除了抗氧化、抗菌、降脂作用外，還有保肝、抗腫瘤、抗肺纖維化等多種生理活性，受到國(guó)內(nèi)外的高度重視，研究進(jìn)展很快[8-10]。目前，對(duì)截葉鐵掃帚中黃酮類化合物的相關(guān)研究不多，本試驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定截葉鐵掃帚中蘆丁、槲皮素、山奈酚三種黃酮類成分含量，這對(duì)于截葉鐵掃帚質(zhì)量控制方法的制定有指導(dǎo)意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

截葉鐵掃帚樣品采自大理州洱源縣茈碧湖鎮(zhèn)豐源村，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院姜北教授鑒定為豆科植物截葉鐵掃帚Lespedezacuneata(Dum. Cours.) G. Don。

1.2 儀器與試劑

試驗(yàn)使用的主要儀器見表1。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080201610)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081201610)、山奈酚對(duì)照品(批號(hào)：110861201611)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為自制超純水，甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

表1 實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)- 0.4%磷酸(B)溶液，梯度洗脫(0～35 min，0%→30% A；36～90 min，30%→55% A)，流速：0.7 mL/min，進(jìn)樣量：16 μL，柱溫：35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：371 nm。在該色譜條件下，蘆丁、槲皮素、山奈酚的保留時(shí)間分別是29.08、46.48和48.88 min；RSD值分別是1.20%、1.43%和0.60%，試驗(yàn)結(jié)果表明色譜峰與其他雜質(zhì)峰有很好的分度(分離度R均小于1.50%)，且都達(dá)到基線分離，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁、槲皮素、山奈酚對(duì)照品2.1、5.2和1.9 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容，使其濃度分別為0.21、0.52和0.19 mg/mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取蘆丁、槲皮素、山奈酚0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL，置10 mL的容量瓶中，然后用甲醇稀釋到刻度線，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

于錐形瓶中精密稱定約1.0 g截葉鐵掃帚藥材粉末，準(zhǔn)確加入25 mL甲醇，超聲處理60 min(功率：500 W，頻率：30 kHz)，取出放冷，再次稱量，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣16 μL，然后測(cè)定其峰面積。以橫坐標(biāo)X表示對(duì)照品進(jìn)樣量，以縱坐標(biāo)Y表示峰面積進(jìn)行回歸分析。蘆丁、槲皮素、山奈酚的回歸方程分別為：Y=644.44X+89.611(r=0.999 3)、Y=6 241.1X-189.69(r=0.999 6)、Y=5 733.7X+5.573 3(r=0.999 3)，蘆丁在0.108～1.681 μg有良好的線性關(guān)系，槲皮素在0.204～4.083 μg有良好的線性關(guān)系，山奈酚在0.072～1.440 μg有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

表2 蘆丁、槲皮素、山奈酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量16 μl，測(cè)定。結(jié)果蘆丁、槲皮素、山奈酚的峰面積RSD分別為0.49%、0.39%、0.22%，結(jié)果表明精密度好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液16 μl，按2.1色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h時(shí)測(cè)定其色譜峰面積。結(jié)果蘆丁RSD為1.30%、槲皮素RSD為1.50%、山奈酚RSD為0.88%，表明10 h內(nèi)蘆丁、槲皮素和山奈酚穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份截葉鐵掃帚葉干燥粗粉，每份約1.0 g，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，進(jìn)樣16 μL，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果蘆丁、槲皮素、山奈酚含量的RSD分別為1.62%，1.30%，0.96%，顯示此方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取約1.0 g已知蘆丁、槲皮素、山奈酚含量的藥材，共6份，精密稱定，分別精密加入3種對(duì)照品溶液各1 mL。按上述樣品制備方法制備，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)6次，測(cè)定各加樣樣品中3種成分含量，算出蘆丁、槲皮素、山奈酚的加樣回收率，取其平均值。結(jié)果蘆丁平均加樣回收率為99.37%，槲皮素平均加樣回收率為100.10%，山奈酚平均加樣回收率為99.42%，RSD分別為1.70%、1.80%、0.79%，結(jié)果見表3。

表3 蘆丁、槲皮素、山奈酚的加樣回收率

續(xù)表3 蘆丁、槲皮素、山奈酚的加樣回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

按上述色譜條件和樣品溶液制備方法，測(cè)定5批截葉鐵掃帚樣品中3種黃酮類化合物含量，結(jié)果見表4。

表4 截葉鐵掃帚樣品中蘆丁、槲皮素、山奈酚含量

3 討論

3.1 截葉鐵掃帚的質(zhì)量控制

截葉鐵掃帚使用廣泛，常用于治療慢性氣管炎、疳積、糖尿病、脾虛腹瀉及脫肛等疾病，其中蘆丁、槲皮素、山奈酚等黃酮類化合物是胡枝子屬植物截葉鐵掃帚的主要成分。截葉鐵掃帚中槲皮素等黃酮類成分能有效抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的增殖，具有抗糖尿病、腎病活性[11]；截葉鐵掃帚50%乙醇提取物中總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基作用[12]。因此，研究截葉鐵掃帚中黃酮類化合物的含量有助于探索其有效成分與療效間的關(guān)系[13]。截葉鐵掃帚作為一種應(yīng)用前景廣闊的中草藥，若質(zhì)量未能得到有效控制，將影響臨床治療效果，故需尋求有效檢測(cè)方法以保證其質(zhì)量。

3.2 樣品溶液制備方法的選擇

采用回流提取和超聲提取兩種不同的提取方法，比較甲醇提取截葉鐵掃帚中蘆丁、槲皮素、山奈酚的效率。結(jié)果顯示，回流提取法提取蘆丁、槲皮素、山奈酚的提取率分別為0.32、0.48、0.15 mg/g，超聲提取法提取蘆丁、槲皮素、山奈酚的提取率分別為0.41、0.52、0.12 mg/g，可見超聲提取法的提取效率優(yōu)于回流提取法，故本試驗(yàn)采用超聲提取法。

3.3 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)過程中考察了乙腈-0.4%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、甲醇-0.2%磷酸等系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇-0.2%磷酸系統(tǒng)，3種黃酮類成分能與雜質(zhì)峰很好的分離，但峰形較差；乙腈-0.4%磷酸作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，出峰較快且峰形較好，但3種黃酮類成分與雜質(zhì)峰不能很好的分離；甲醇-0.4%磷酸的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)3種黃酮類成分有較好的分離效果且峰形較好，故選擇甲醇-0.4%磷酸作為流動(dòng)相系統(tǒng)。采用不同比例的甲醇-0.4%磷酸洗脫并與梯度洗脫結(jié)合，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.4%磷酸梯度洗脫(0～35 min，0%→30% A；36～90 min，30%→55% A)分離效果最佳，故以此作為流動(dòng)相條件。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)中對(duì)蘆丁、槲皮素、山奈酚的紫外光譜最佳吸收波長(zhǎng)進(jìn)行了探索，考察了190～400 nm不同波長(zhǎng)的吸收?qǐng)D譜，發(fā)現(xiàn)在371 nm處蘆丁、槲皮素、山奈酚均具有很好的吸收?qǐng)D譜，且干擾小，分離效果好，故將371 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定截葉鐵掃帚中蘆丁、槲皮素、山奈酚的含量，對(duì)評(píng)價(jià)截葉鐵掃帚的質(zhì)量具有參考意義，為截葉鐵掃帚的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。