分化拮抗非編碼RNA-201 對單核-巨噬細胞功能的調(diào)控研究

周海清，劉洋，陳宇，李榮霞，楊淑均，張偉麗

心腦血管疾病是危害我國居民生命健康的“第一殺手”，患病人數(shù)達2.9 億，居總死亡率的首位[1]。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，循環(huán)血中的單核細胞遷移并黏附于活化的血管內(nèi)皮細胞，浸潤至內(nèi)膜下層形成巨噬細胞是動脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)，單核-巨噬細胞通過表型轉(zhuǎn)換和分泌炎癥因子等機制調(diào)控動脈粥樣硬化發(fā)展的各個階段[2-3]。斑塊的穩(wěn)定性決定了動脈粥樣硬化的危險程度，穩(wěn)定斑塊可不產(chǎn)生臨床癥狀，而不穩(wěn)定斑塊發(fā)生破裂、血栓形成后，可引發(fā)冠心病、腦卒中等急性心腦血管事件[4]。因此，探究斑塊穩(wěn)定性的機制和分子標(biāo)志物是早期預(yù)防心腦血管事件的關(guān)鍵。

長鏈非編碼RNA 分子（lncRNA）是一類長度大于 200 個堿基，沒有蛋白質(zhì)編碼潛能的核苷酸序列，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面調(diào)控基因達，在細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[5]。LncRNA 在動脈粥樣硬化病理生理中的作用受到廣泛關(guān)注。我們在冠心病易損斑塊患者外周血中鑒別出一種與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性相關(guān)的新的lncRNA 分子，即分化拮抗非編碼RNA-201（differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR-201）。DANCR-201 是DANCR 最 重要的轉(zhuǎn)錄本（轉(zhuǎn)錄本序列號：ENST00000411630.6），位于人4 號染色體。DANCR 在表皮細胞分化過程、干細胞特性維持以及腫瘤進展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，影響細胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)[6-7]。DANCR-201 在動脈粥樣硬化中的作用鮮有報道。本工作擬研究DANCR-201 對單核-巨噬細胞炎癥反應(yīng)及其功能的影響，為闡明動脈粥樣硬化斑塊形成的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 細胞與試劑

實驗細胞：人單核細胞白血病細胞系（THP）-1細胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會）。主要試劑包括：胎牛血清、無酚紅RPMI-1640 培養(yǎng)基（均購自Gibco 公司，美國）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、牛血清蛋白和油紅O 染料（均購自Sigma 公司，美國）；干擾素-γ 和白細胞介素-4（IL-4）（均購自PeproTech 公司，美國）；Lipofectamine 3000 和NBD膽固醇（22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol）（均購自Invitrogen 公司，美國）；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）和乙?；兔芏戎鞍祝ň徸詮V州奕源生物技術(shù)有限公司，中國）；重組人載脂蛋白A1（Abcam公司，英國）；Trizol（Thermo fisher 公司，美國）；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（Takara 公司，日本）；SYBR Green qPCR Mix（上海翊圣生物科技有限公司，中國）。主要耗材包括：96 孔黑色細胞培養(yǎng)板（Corning 公司，美國）；TempusTMBlood RNA Tube 采血管和TempusTMSpin RNA Isolation Kit 試劑盒（均購自Applied Biosystems公司，美國）。

DANCR-201 慢病毒載體購自上海吉凱基因科技有限公司（中國），該慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，可將DANCR-201 高效導(dǎo)入細胞系。DANCR-201 Smart Silencer 購自廣州銳博科技有限公司（中國），這是一種包括三條小干擾RNA 和三條反義寡核苷酸的混合物，靶向DANCR-201 的不同序列位點，可有效提高細胞中DANCR-201 的敲低效率。

1.2 方法

1.2.1 研究對象及分組

納入中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院疑為冠心病接受冠狀動脈CT 檢查的患者25例，年齡≥45 歲。排除血液疾病、消化性潰瘍、肝腎功能不全、感染、自身免疫疾病和腫瘤患者。使用64 排螺旋CT 進行冠狀動脈掃描，兩名放射科醫(yī)師分別對冠狀動脈圖像進行分析。冠狀動脈粥樣硬化斑塊特點分型：明顯區(qū)別于冠狀動脈管腔，且＞1 mm2的結(jié)構(gòu)被判定為動脈粥樣硬化斑塊[8]；斑塊中CT值＞130 HU 的高密度成分≥70 %，被定義為鈣化斑塊[9]；易損斑塊則包含脂質(zhì)、纖維和鈣化等成分[10]；冠狀動脈無＞1 mm2斑塊者為無斑塊健康對照組。根據(jù)冠狀動脈CT 血管造影圖像，25例患者分為3組，包括無斑塊健康對照組（n=10）、完全鈣化斑塊組（n=10）和易損斑塊組（n=5）。研究已通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有的入選患者均已簽署知情同意。

血標(biāo)本來自于晨起空腹抽血。使用TempusTMBlood RNA Tube 采血管收集患者外周血2～3 ml，立即劇烈震蕩15～30 s，充分混勻，隨后使用TempusTMSpin RNA Isolation Kit 試劑盒提取總RNA，-80℃儲存，用于全轉(zhuǎn)錄組測序檢測。

1.2.2 單核-巨噬細胞的培養(yǎng)

用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1 單核細胞，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代。將對數(shù)生長期的THP-1 細胞以2×105/孔的密度接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，用于建立M1 和M2 型巨噬細胞極化模型：在培養(yǎng)基中加入10 μl 佛波酯（10 ng/ml），孵育48 h后THP-1細胞分化成為M0型巨噬細胞；在M0 型巨噬細胞中加入2 μl 脂多糖（0.5 ng/ml）和2 μl 干擾素-γ（10 ng/ml），孵育24 h，使其極化為M1 型巨噬細胞（促炎型巨噬細胞）；在M0 型巨噬細胞中加入2 μl IL-4（10 ng/ml），孵育24 h，使其極化為M2 型巨噬細胞（抑炎型巨噬細胞）。

1.2.3 過表達或敲低DANCR-201 的細胞模型

渠道融合式閱讀推廣的“融合”更強調(diào)integration和cohesion，即側(cè)重于多種閱讀推廣渠道的有機整合應(yīng)用，使其產(chǎn)生一種聚合力。

將對數(shù)生長期的THP-1 細胞以1×105/孔的密度接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，感染DANCR-201 慢病毒載體，培養(yǎng)72 h 后使用流式細胞分選儀（FACS Aria 2 Flow Cytometry/Cell Sorting System，美國）篩選表達綠色熒光蛋白標(biāo)簽的THP-1 細胞，建立穩(wěn)定表達DANCR-201 的細胞系。用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染DANCR-201 Smart Silencer，培養(yǎng)48 h 后，檢測巨噬細胞中DANCR-201 的表達效率，建立敲低DANCR-201 的細胞模型。

1.2.4 油紅O 染色實驗

將對數(shù)生長期的THP-1 細胞以2×105/孔的密度接種于底部放置蓋玻片的12 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μl 佛波酯（10 ng/ml）誘導(dǎo)48 h，然后更換為含1%牛血清蛋白的 RPMI-1640 培養(yǎng)基，每孔加入終濃度50 μg/ml 的ox-LDL 刺激12 h，誘導(dǎo)分化為泡沫巨噬細胞。取出載玻片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔沖洗，然后將載玻片置于0.3%油紅O 染色液中染色2 min，接著用蘇木素伊紅染色液復(fù)染細胞核2 min。洗去浮色，使用甘油封片，在Leica DM6000B光學(xué)顯微鏡（Leica Microsystems,德國）下觀察巨噬細胞的脂質(zhì)吞噬能力，細胞核呈現(xiàn)藍色，脂滴為紅色，每孔隨機拍攝5 個視野，每個視野下約20 個細胞。

1.2.5 膽固醇流出實驗

將對數(shù)生長期的THP-1 細胞以1×104/孔的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入1 μl 佛波酯（10 ng/ml）誘導(dǎo)48 h 后，更換為含0.2%牛血清蛋白的RPMI-1640 培養(yǎng)基，每孔加入終濃度5 μg/ml 的NBD 膽固醇和50 μg/ml 的乙?；兔芏戎鞍?，共同孵育12 h。使用無酚紅RPMI-1640 培養(yǎng)基輕柔洗滌細胞2 次，接著每孔給予終濃度20 μg/ml 的重組人載脂蛋白A1（溶于含0.2% 牛血清蛋白的RPMI-1640 培養(yǎng)基中）刺激4 h，誘導(dǎo)細胞的膽固醇外流。吸取細胞上清培養(yǎng)液并保存于96 孔黑色細胞培養(yǎng)板中，然后在細胞中每孔加入100 μl 0.1% Triton X-100細胞裂解液，充分吹打、震蕩30 min。采用Infinite M200 Pro 光柵型多功能酶標(biāo)儀（Tecan,瑞士）分別檢測上清培養(yǎng)液與細胞裂解液的熒光強度值，吸收光469 nm，發(fā)射光537 nm。膽固醇流出率用上清液熒光值除以總熒光值（上清和細胞沉淀熒光值之和）的比值乘以100%來表示。

1.2.6 實時熒光定量PCR 法檢測基因表達水平

使用RNA 抽提試劑Trizol 提取巨噬細胞的總RNA，繼而用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系以cDNA 為模板，加入SYBR Green qPCR Mix 和引物序列，采用ABI ViiA7 System（Applied Biosystems，美國）檢測基因的mRNA 表達水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，ΔΔCt 法計算基因的mRNA 相對表達量。實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系為：（1）5 μl 2×SYBR PCR mix；（2）0.5 μl 正向引物，0.5 μl 反向引物；（3）3 μl 模板 cDNA；（4）1 μl ddH2O。反應(yīng)條件為：（1）94 ℃預(yù)變性3 min；（2）94 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，40 個循環(huán)；（3）72 ℃后延伸10 min。檢測基因的引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量變量使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DANCR-201 在易損斑塊組患者的外周血中高表達

采用全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測無斑塊健康對照組、完全鈣化斑塊組和易損斑塊組患者外周血中表達差異的lncRNA 分子，發(fā)現(xiàn)有23 個lncRNA 存在差異表達。進一步驗證測序發(fā)現(xiàn)DANCR-201 在易損斑塊組患者外周血中的表達水平顯著升高，分別為無斑塊健康對照組的1.6 倍和完全鈣化斑塊組的1.2 倍（P＜0.01，圖1）。這提示其可能參與動脈粥樣硬化斑塊形成的病理生理過程，因此擬探究DANCR-201 是否通過調(diào)控巨噬細胞相關(guān)功能影響動脈粥樣硬化斑塊形成。

2.2 DANCR-201 促進單核-巨噬細胞的炎癥反應(yīng)

首先，通過檢測M1 和M2 型巨噬細胞的標(biāo)志分子確定巨噬細胞極化模型是否成功建立。結(jié)果顯示，M1 型巨噬細胞標(biāo)志物單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）在M1 型巨噬細胞中表達顯著增高（P＜0.01），M2 型巨噬細胞標(biāo)志物白細胞介素-10（IL-10）在M2 型巨噬細胞表達顯著增高（P＜0.01），說明巨噬細胞極化模型成功建立（圖2）。

圖1 三組患者外周血中DANCR-201 表達水平比較

圖2 M0、M1 和M2 型巨噬細胞的炎癥因子表達水平（n=5）

采用實時熒光定量PCR 法檢測慢病毒穩(wěn)定過表達DANCR-201 的不同亞型單核-巨噬細胞中炎癥因子表達水平。結(jié)果顯示，與慢病毒過表達對照組比較，在THP-1 細胞中，DANCR-201 顯著促進炎癥因子MCP-1 和TNF-α 的表達水平，分別為慢病毒過表達對照組的1.5 倍和1.2 倍（P＜0.01）；反之，采用ASO 技術(shù)敲低DANCR-201 時，MCP-1和TNF-α 的表達水平顯著降低（P＜0.01，圖3A）。在M1 型巨噬細胞中，DANCR-201 顯著抑制抗炎因子IL-10 的表達水平（P＜0.01，圖3B）。在M2 型巨噬細胞中，DANCR-201 顯著促進炎癥因子TNF-α的表達水平，約為敲低對照組的1.5 倍（P＜0.01）；敲低DANCR-201 時，TNF-α 表達水平下降37%（P＜0.01，圖3C）。

2.3 DANCR-201 調(diào)節(jié)鈣化相關(guān)基因的表達（圖4）

建立慢病毒穩(wěn)定過表達DANCR-201 的單核-巨噬細胞系，采用實時熒光定量PCR 法檢測單核-巨噬細胞中鈣化相關(guān)基因的表達改變。結(jié)果顯示，與對照組比較，在M1 和M2 型巨噬細胞中，DANCR-201 顯著抑制Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx 2）的表達水平（P＜0.01），并同時促進骨保護素（OPG）的高表達（P＜0.05）。反之，采用ASO 技術(shù)敲低DANCR-201 時，M1 和M2 型巨噬細胞中的Runx 2表達水平升高（P＜0.01），而OPG 的表達水平下降（P＜0.01）。

2.4 DANCR-201 對單核-巨噬細胞脂質(zhì)吞噬能力的影響

采用油紅O 染色法觀察DANCR-201 對巨噬細胞脂質(zhì)吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)過表達或者敲低DANCR-201 時，巨噬細胞脂滴形成和脂質(zhì)攝取能力與對照組比較無顯著差異，脂質(zhì)吞噬相關(guān)基因血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體（LOX-1）、清道夫受體CD36、A1 類清道夫受體（SR-A1）的表達水平與對照組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 DANCR-201 對不同類型巨噬細胞炎癥反應(yīng)的影響（n=5）

圖4 DANCR-201 對巨噬細胞中鈣化相關(guān)基因表達水平的影響（n=5）

2.5 DANCR-201 對巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運能力的影響（圖5）

采用膽固醇流出實驗檢測巨噬細胞膽固醇流出率，觀察DANCR-201 對巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運能力的影響。結(jié)果顯示，敲低DANCR-201 對巨噬細胞膽固醇流出率無顯著影響。過表達DANCR-201 可促進M1 型巨噬細胞中ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ABCG1）的表達水平增加30%（P＜0.05），而膽固醇外排相關(guān)基因如B1 類清道夫受體（SR-B1）、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）等表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 DANCR-201 對巨噬細胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達水平的影響（n=5）

3 討論

動脈粥樣硬化實質(zhì)上是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病，單核/巨噬細胞是炎癥反應(yīng)的核心[11-12]。本研究通過全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)lncRNA 分子DANCR-201 在冠狀動脈易損斑塊組患者外周全血中的表達水平顯著高于健康對照組和鈣化斑塊組患者，進一步的細胞實驗研究顯示DANCR-201 能夠促進單核-巨噬細胞釋放趨化因子MCP-1 和炎癥因子TNF-α 等，并顯著下調(diào)鈣化相關(guān)基因Runx 2的表達水平，但對巨噬細胞脂質(zhì)吞噬和膽固醇逆轉(zhuǎn)運能力無顯著影響，提示DANCR-201 可能通過影響單核-巨噬細胞炎癥反應(yīng)可以促進動脈粥樣硬化進程。

研究表明急性冠狀動脈綜合征患者的外周血MCP-1 水平顯著升高，且與心血管病死亡率增高密切相關(guān)，MCP-1 高表達能夠促進單核細胞大量增殖并進一步向動脈粥樣硬化病變部位聚集[13-15]。TNF-α 作為一種強效炎性因子，可促進單核細胞向內(nèi)皮細胞黏附，促進巨噬細胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，從而影響動脈粥樣硬化發(fā)展。MCP-1、TNF-α等多種炎性因子共同作用，能顯著增加動脈粥樣硬化晚期斑塊破裂出血與血栓形成的風(fēng)險，誘發(fā)急性心腦血管事件[16-17]。本研究結(jié)果顯示DANCR-201在冠狀動脈易損斑塊組患者外周血中的表達水平升高，可促進單核細胞釋放MCP-1、TNF-α。這提示DANCR-201 可能通過調(diào)控單核巨噬細胞炎癥反應(yīng)影響動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞主要分為M1促炎亞型和M2 抗炎亞型，在特定的環(huán)境下可發(fā)生相互轉(zhuǎn)換進而影響斑塊形成[18]。M1 型巨噬細胞在不穩(wěn)定斑塊中大量存在，通過分泌TNF-α、IL-1β和IL-6 等促進動脈粥樣硬化發(fā)展，而M2 型巨噬細胞主要存在于較穩(wěn)定的鈣化斑塊中，分泌抗炎因子IL-10，發(fā)揮抑制斑塊形成的作用[19]。本研究中，DANCR-201 能夠顯著促進M1 型巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α，抑制抗炎因子IL-10 表達，同時促進M2 型巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α。這提示DANCR-201 在兩種類型巨噬細胞中均發(fā)揮促炎癥作用，可能影響動脈粥樣硬化中晚期的發(fā)展。

此外，血管鈣化是動脈粥樣硬化發(fā)展中的一種常見的病理特征，管腔表面鈣鹽結(jié)晶聚集使斑塊更易破裂形成血栓，而在動脈粥樣硬化中晚期，鈣化性斑塊逐漸融合，形成較厚的鈣化帽能夠使斑塊更趨于穩(wěn)定，有效防止急性血栓形成，并限制斑塊形成。Runx 2 是細胞成骨分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可作為鈣化形成的早期標(biāo)志[20]。OPG 是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，OPG 水平升高與機體對抗血管鈣化的自我保護機制密切相關(guān)[21]。我們發(fā)現(xiàn)在M1、M2 型巨噬細胞中，DANCR-201 可顯著抑制Runx 2，并上調(diào)OPG 的表達水平，這提示其在鈣化形成中發(fā)揮著重要作用。DANCR-201 在動脈粥樣硬化斑塊形成中的分子機制，還需實驗證據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DANCR-201 在冠狀動脈易損斑塊組患者外周血中的表達水平顯著高于健康對照組和鈣化斑塊組患者，可促進單核-巨噬細胞釋放趨化因子MCP-1 和炎癥因子TNF-α 等，并顯著下調(diào)鈣化相關(guān)基因Runx 2 的表達水平，這提示DANCR-201 調(diào)控單核-巨噬細胞的炎癥反應(yīng)。該lncRNA 分子在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用機制仍需進一步深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突