王付娟，李宗震，仝勝利，李淑梅

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450002)

隨著全球氣候變化，高溫和干旱已經(jīng)嚴(yán)重影響到小麥碳同化和淀粉合成，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[1-2]。干旱常常伴隨高溫，高溫直接導(dǎo)致許多不耐熱蛋白質(zhì)變性和植物細(xì)胞中活性氧(ROS)積累[3-4]。植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了應(yīng)對(duì)逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制，包括誘導(dǎo)大量熱激蛋白(heat shock protein,Hsps)和ROS清除劑等基因的表達(dá)。在熱適應(yīng)過(guò)程中，熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factors,Hsfs)對(duì)熱誘導(dǎo)的重建轉(zhuǎn)錄起著重要的調(diào)控作用[5]。

熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于所有真核生物中。Hsfs蛋白的特征是存在一個(gè)Hsf DNA結(jié)合域，該域由一個(gè)中心螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋基序和兩個(gè)疏水氨基酸重復(fù)片段(HR-A and HR-B)組成[6]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定，擬南芥中21個(gè)Hsf蛋白[7]，水稻中25個(gè)Hsf蛋白[7-8]，大麥中28個(gè)Hsf蛋白[9]，大豆中34個(gè)Hsf蛋白[10]，棉花中40個(gè)Hsf蛋白[11]，小麥中56個(gè)Hsf蛋白[12]。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)將Hsf蛋白劃分為A、B和C三個(gè)亞家族，HsfA已經(jīng)在擬南芥和水稻等植物中被廣泛研究，發(fā)現(xiàn)AtHsfA1a和AtHsfA1b參與調(diào)節(jié)擬南芥應(yīng)激基因的早期表達(dá)[13]；過(guò)表達(dá)GmHsfA1能夠顯著提高大豆的耐熱性[14-15]；擬南芥中超表達(dá)AtHsfA2基因，其耐強(qiáng)光、耐鹽、耐高滲透脅迫和抗氧化能力顯著提高[15-17]。超表達(dá)OsHsfA2e使擬南芥的耐鹽能力顯著提高[18]，但超表達(dá)SlHsfA3使擬南芥的鹽敏感性顯著提高[19]。水稻和小麥中超表達(dá)HsfA4a均顯著提高其抗重金屬元素鎘的能力和抗氧化能力[20]。HsfB亞家族成員在植物受高溫脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用，擬南芥中HsfB1和HsfB2b在正常條件下抑制HsfA2和HsfA7基因的表達(dá)，對(duì)植株提高耐熱性發(fā)揮積極作用[21]。有研究表明，擬南芥HsfB1和HsfB2b在提高抗病性方面也發(fā)揮著積極作用[22]。水稻中HsfC基因除了在熱脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用外，還參與了對(duì)鹽、干旱和氧化應(yīng)激等的應(yīng)激反應(yīng)[23-25]。OsHsfC1b和OsHsfC2b對(duì)鹽和干旱非常敏感，TaHsfC2a-B在小麥籽粒灌漿過(guò)程中發(fā)揮著熱保護(hù)作用[26]。

小麥作為重要的糧食作物，揚(yáng)花期和灌漿期遭遇干熱風(fēng)和干旱的頻率激增，更多有重要功能的熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子有待挖掘，尤其是TaHsfC亞家族基因。為深入了解此基因的功能，本研究擬通過(guò)小麥全基因組生物信息學(xué)分析，根據(jù)擬南芥和水稻HsfC家族成員蛋白的保守結(jié)構(gòu)域鑒定小麥HsfC家族成員，并利用不同小麥品種在干旱條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其表達(dá)模式，為探究TaHsfCs介導(dǎo)小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TaHsfC全基因組檢索以及鑒定

根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(Tair:https://www.arabidopsis.org/)中公布的AtHsfC1(AT3G24520)所編碼的氨基酸序列，通過(guò)Hmmer(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)工具獲得其Pfam號(hào)，然后利用Pfam號(hào)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/biomart/martview/)在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得TaHsf家族候選基因的堿基、蛋白的氨基酸和CDS序列。將候選基因?qū)?yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的AtHsfC1(AT3G24520)、OsHsfC2a(Os02g13800)、OsHsfC2b(Os06g35960)、OsHsfC1a(Os01g43590)和OsHsfC1b(Os01g53220)的對(duì)應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化分析，利用 Mega7.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建方法為鄰近法。以進(jìn)化關(guān)系距離大于80%為標(biāo)準(zhǔn)確定TaHsfC亞家族成員。

1.2 TaHsfC生物信息學(xué)分析

利用 Mega 7.0 軟件構(gòu)建TaHsfC蛋白序列進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建方法為鄰近法，bootstrap設(shè)置為 1 000。用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線軟件分析TaHsfC基因結(jié)構(gòu)。利用Softberry(http://linux1.softberry.com/)在線軟件進(jìn)行TaHsfC亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)查詢TaHsfC蛋白質(zhì)的HSF結(jié)構(gòu)域位置和卷曲螺旋位置。利用MG2C在線軟件(http://mg2c.iask.in/mg2cv2.0/)繪制TaHsfC基因在各染色體上的位置。

1.3 TaHsfC對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

以矮抗58(不耐旱品種)和晉麥47(耐旱品種)作為研究材料，將萌發(fā)5 d的苗移栽到營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)7 d之后，采用添加15%的PEG的營(yíng)養(yǎng)液模擬干旱處理24 h，以正常培養(yǎng)的苗為對(duì)照，分別取根系提取RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，分析響應(yīng)干旱的TaHsfC基因表達(dá)情況，用 Cufflinks 軟件(http://cufflinks.cbcb.umd.edu/)計(jì)算各基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，表達(dá)豐度用FPKM值來(lái)表示。根據(jù)各樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中各TaHsfC基因的 FPKM 值對(duì)其基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，用TBtools軟件中的Heatmap工具對(duì)表達(dá)模式作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaHsfC在染色體上的分布及亞細(xì)胞定位

從小麥全基因組中共鑒定到24個(gè)TaHsfC基因(表1)，其不均勻分布在5條染色體上，其中A基因組中有7個(gè)，B 基因組中9個(gè)，D基因組中有6個(gè)，另外兩個(gè)所在染色體位置不清楚(圖2)。在3號(hào)染色體上最多，有12個(gè)；在4號(hào)染色體上有5個(gè)；5號(hào)染色體上有2個(gè)；7號(hào)染色體上有3個(gè)；有2 個(gè)基因在染色體上的位置未知。對(duì)24個(gè)TaHsfC基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析顯示，24個(gè)TaHsfC基因全部定位于細(xì)胞核。

表1 小麥TaHsfC基因家族的特性

圖1 小麥TaHsfC家族基因的染色體分布

*代表新鑒定的TaHsfC蛋白。

2.2 小麥TaHsfC聚類分析

TaHsfC蛋白的亞類分類方法是基于Scharf等[5]對(duì)擬南芥和水稻Hsf蛋白分類。由圖2可以看出，與已鑒定的擬南芥和水稻中的HsfC蛋白(AtHsfC1、OsHsfC2a、OsHsfC2b、OsHsfC1a和OsHsfC1b)進(jìn)行聚類比對(duì)，24個(gè)被鑒定的TaHsfC蛋白成員可以明顯的分為兩大類。其中，有 12個(gè)TaHsfC蛋白已經(jīng)被報(bào)道過(guò)[12]，分別為 TaHsfC1a-e和TaHsfC2a-g。新鑒定的12個(gè)TaHsfC蛋白聚類為兩組，分別命名為TaHsfC1f-k和TaHsfC2h-m(圖2中被標(biāo)記*)。與擬南芥相比，小麥HsfC蛋白與水稻HsfC蛋白的聚類更緊密，并且HsfC2亞族在單子葉植物中是唯一的。

2.3 小麥TaHsfC基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)鑒定的24個(gè)TaHsfC基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，TaHsfC1亞族基因至少含有一個(gè)內(nèi)含子，其中TaHsfC1h含有兩個(gè)內(nèi)含子；TaHsfC2亞族基因則規(guī)律不清，其中TaHsfC2a、TaHsfC2b和TaHsfC2m含有一個(gè)內(nèi)含子，其余成員則不含內(nèi)含子。

24個(gè)TaHsfC基因中，有7組同源基因，同源基因的結(jié)構(gòu)具有相似性(圖3)，其中有5組可能為A、B和D染色體組上的等位基因(c2e、c2g、c2i;c2a、c2b、c2m;c1b、c1c、c1d;c1a、c1e、c1f;c1j、c1h、c1k)，另外2組可能為其中兩組染色體上的等位基因(c2j、c2k;c2c、c2l)。

圖3 小麥TaHsfCs基因結(jié)構(gòu)分析

小麥TaHsfCs序列的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示(圖4)，所有被鑒定的小麥TaHsfCs中均有基序1(motif 1)、基序2(motif 2)和基序3(motif 3)，其中TaHsfC2a中包含HSF的AHA基序(AHA motif序列：LLLDGDFGNVSAFGPDAVDFAGFYTDDAFANAPVPVE)。

圖4 小麥TaHsfCs的保守結(jié)構(gòu)域分析

小麥HsfCs DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)分析結(jié)果顯示(圖5)，小麥HsfC亞族蛋白質(zhì)包含“螺旋-折疊-螺旋”的結(jié)構(gòu)域，屬于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有DNA結(jié)合特性，所鑒定的24個(gè)小麥HsfCs功能可能具有相似性。

圖5 小麥HsfCs DNA結(jié)合域的多序列比對(duì)

2.4 TaHsfC基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)

以矮抗58和晉麥47兩個(gè)品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析響應(yīng)干旱的TaHsfC基因，將達(dá)到顯著差異的TaHsfC基因通過(guò)FPKM值制作熱圖(圖6)。從圖6可見(jiàn)，小麥品種矮抗58和晉麥47共同存在差異表達(dá)的TaHsfC基因有10個(gè)，占比 66.7%，其中TaHsfC2亞族基因占70%，且表達(dá)量均高于TaHsfC1亞族基因。表明TaHsfC2亞族基因在響應(yīng)干旱脅迫中具有重要的作用。其中，TaHsfC2b、TaHsfC2c、TaHsfC2d、TaHsfC2f、TaHsfC2g和TaHsfC2m在兩個(gè)品種中受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)幅度最大，表明這些基因在小麥干旱脅迫中發(fā)揮著積極響應(yīng)作用。不同的TaHsfC1和TaHsfC2亞族基因在干旱響應(yīng)中的表達(dá)存在較大差異，整體以TaHsfC2亞族基因在干旱處理過(guò)程中上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較高，TaHsfC1亞族基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)則相對(duì)較低。晉麥47在干旱處理中有4個(gè)基因(TaHsfC2j、TaHsfC2k、TaHsfC1f和TaHsfC1c)未表現(xiàn)出顯著變化，而TaHsfC2i在晉麥47中表現(xiàn)出顯著差異。

圖6 響應(yīng)干旱脅迫的TaHsfC基因的表達(dá)模式分析

3 討 論

本研究在小麥基因組中共鑒定了24個(gè)TaHsfC亞族基因成員，可以分為TaHsfC1和TaHsfC2兩個(gè)亞族。從進(jìn)化樹(shù)分析可見(jiàn)，小麥的TaHsfC亞族基因與水稻更為緊密。與擬南芥不同的是，小麥和水稻均有TaHsfC2亞族基因，這是禾本科植物所特有的一類基因。大量研究表明，熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)龐大的基因家族，可以被分為A、B和C三個(gè)亞家族，且在植物的耐熱、抗寒、抗旱及耐鹽等多種脅迫條件下發(fā)揮重要作用，但是由于小麥基因組的復(fù)雜性，對(duì)其TaHsfC亞族基因的功能研究仍然較少，已經(jīng)公開(kāi)報(bào)道的只有TaHsfC2a通過(guò)ABA介導(dǎo)調(diào)控途徑參與小麥灌漿期的耐熱性保護(hù)機(jī)制[26]。本研究主要利用小麥基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)TaHsfC亞族基因進(jìn)行全基因組系統(tǒng)分析，試圖為研究TaHsfC亞族基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

在聚類分析中發(fā)現(xiàn)，鑒定出的24個(gè)TaHsfC亞族基因中存在5組三聯(lián)等位基因和2組二聯(lián)等位基因，其親緣關(guān)系高度相似，這可能與六倍體小麥復(fù)雜的基因組相關(guān)，基因之間存在多個(gè)復(fù)制。前人研究報(bào)道，隨著基因組的復(fù)雜性增加，熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量也隨之增加；這種家族基因數(shù)量的增加意味著該基因家族可能在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用[27]。在鑒定的24個(gè)TaHsfC亞族基因中，均具有熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域。這24個(gè)被鑒定的小麥TaHsfC亞族基因的成員中，有12個(gè)是本研究初次發(fā)現(xiàn)，這為以后的研究提供了一定的基礎(chǔ)信息。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，全部的TaHsfC定位于細(xì)胞核，這與其功能密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄過(guò)程是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的。

大部分Hsfs家族成員是通過(guò)調(diào)控一系列熱激蛋白，活性氧清除酶和其他功能蛋白基因發(fā)揮抗逆作用的[28]。熱激轉(zhuǎn)錄因子的下游基因熱激蛋白作為分子伴侶可以防止細(xì)胞蛋白質(zhì)在熱應(yīng)激下變性[27-28]，同時(shí)也參與生物體對(duì)熱脅迫的適應(yīng)[29]。Hu等[26]研究表明，小麥中過(guò)表達(dá)TaHsfC2a-B基因能夠上調(diào)一系列熱保護(hù)基因，包括TaHSP16.9b、TaHSP17.3、TaHSP26.6、TaHSP62.4、TaHSP70d、HSP101b、TaGalSyn、TaHSA32、TaRof1和TaβAmy1。本研究證明了TaHsfC2a可被干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；但是過(guò)表達(dá)TaHsfC2a-B基因并不能提高小麥的抗旱性，TaHsfC2a-B過(guò)表達(dá)能夠抑制植株的生長(zhǎng)；在各個(gè)營(yíng)養(yǎng)器官中TaHsfC2a基因干旱誘導(dǎo)的生理意義可能在于干旱脅迫下水分的保存。在本研究中，耐旱品種晉麥47和干旱敏感型品種矮抗58中均表現(xiàn)出TaHsfC2a基因在干旱條件下上調(diào)表達(dá)。本研究鑒定到的TaHsfC2b和TaHsfC2m與TaHsfC2a具有極高的同源性，此三者之間的功能有可能也是相似的。盡管其他的TaHsfC2亞族基因也能夠受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，但是具體的功能則有待進(jìn)一步的研究。