王偉東，常慶瑞，王玉娜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

葉綠素、類胡蘿卜素和花青素是植物體中的主要色素，廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中，并會(huì)隨著環(huán)境變化而呈現(xiàn)出不同顏色，它們的相對(duì)含量能夠反映植物生理狀態(tài)和物候狀況[1]?；ㄇ嗨貫橹参锶~片中的第三大色素，是一種水溶性黃酮類化合物[2]，在小麥、玉米等農(nóng)作物的胚芽鞘、莖稈等部位也有積累[3]?；ㄇ嗨鼐哂卸喾N功能，如有較強(qiáng)的抗氧化性，不僅有助于葉片損傷修復(fù)[4]，而且可以用于藥物，預(yù)防冠心病、血栓等慢性病治療[5-6]；花青素也可以通過吸收光能而減少葉綠素對(duì)光的吸收，潛在地調(diào)節(jié)光合作用，從而起到光保護(hù)的作用[7]。因此，了解花青素的存在，檢測花青素的含量對(duì)于農(nóng)田管理和檢測具有重要作用[8]。

傳統(tǒng)測量花青素含量的方法主要有微波法[9]、高效液相色譜法[10]以及分光光度計(jì)法[11]等，但是這些方法在檢測花青素含量時(shí)不但浪費(fèi)人力物力，而且毀壞葉片，也不能迅速、即時(shí)地大面積監(jiān)測，因此需要一種精確且高效的方法來預(yù)測花青素含量[12]。高光譜能夠快速、準(zhǔn)確、無破壞性地重復(fù)檢測花青素，故而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用和植物生理研究方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿13]。

高光譜遙感反演預(yù)測植被理化指數(shù)的方法在過去幾十年里取得重大進(jìn)步，但大多集中在葉綠素和類胡蘿卜素，對(duì)于花青素的研究甚少[14-15]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過選擇對(duì)花青素敏感的綠光波段和對(duì)葉綠素敏感的紅光波段與近紅外波段組合，構(gòu)建不同的光譜指數(shù)，可以有效地對(duì)一種或多種植物葉片花青素含量進(jìn)行反演，例如紅綠指數(shù)、花青素含量指數(shù)、調(diào)整花青素含量指數(shù)、花青素反射指數(shù)以及調(diào)整花青素反射指數(shù)等[16-17]，但是當(dāng)作物種類發(fā)生變化時(shí)，葉片中葉綠素和花青素的含量發(fā)生變化，高光譜敏感波段也隨之改變，上述指數(shù)則不適用，需要進(jìn)一步修正，尋找新的光譜指數(shù)。近年來，偏最小二乘法(PLS)作為一種新型的多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法，被廣泛用于植物色素高光譜預(yù)測中，該方法在使用時(shí)可以最大地利用光譜信息，以取得較好的預(yù)測效果。小麥作為當(dāng)今世界重要的糧食作物，但關(guān)于小麥花青素的研究卻很少。本研究以關(guān)中地區(qū)的冬小麥為對(duì)象，利用SVC HR-1024i便攜式光譜儀獲取光譜數(shù)據(jù)，用Dualex Scientific+便攜式測定器獲取花青素相對(duì)含量數(shù)據(jù)，基于光譜數(shù)據(jù)分析不同生育時(shí)期的冬小麥葉片光譜特征，以不同波段任意組合的RSI、DSI、NDSI光譜指數(shù)為自變量構(gòu)建一元回歸模型，利用PLS構(gòu)建多元回歸模型，最終確定冬小麥葉片花青素相對(duì)含量的最優(yōu)預(yù)測模型，以期為冬小麥農(nóng)田信息快速獲取與生長狀況監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)和有效手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

本研究于2016-2017年度冬小麥田間試驗(yàn)進(jìn)行。研究區(qū)位于陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(108°10′E，34°14′N)和咸陽市乾縣梁山鎮(zhèn)齊南村(108°07′E，34°38′N)，供試品種為小偃22。楊凌試驗(yàn)點(diǎn)共設(shè)20個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為27.5 m2(5 m×5.5 m)，試驗(yàn)設(shè)氮、磷兩種養(yǎng)分處理，每種養(yǎng)分設(shè)5個(gè)施肥水平，每個(gè)水平設(shè)2個(gè)重復(fù)，其中施氮水平分別為0、45、90、135和180 kg N·hm-2，施磷水平分別為0、22.5、45、67.5和90 kg P2O5·hm-2。乾縣試驗(yàn)點(diǎn)共設(shè)36個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為90 m2(9 m×10 m)，試驗(yàn)設(shè)氮、磷、鉀三種養(yǎng)分處理，每種養(yǎng)分設(shè)6個(gè)施肥水平，每個(gè)處理設(shè)2個(gè)重復(fù)，其中施氮水平分別為0、30、60、90、120和150 kg N·hm-2，施磷水平分別為0、22.5、45、67.5、90和112.5 kg P2O5·hm-2，施鉀水平分別為0、22.5、45、67.5、90和112.5 kg K2O·hm-2；另設(shè)，5個(gè)大田試驗(yàn)，每個(gè)大田面積為150 m2(15 m×10 m)，設(shè)0、60、120、180和240 kg·hm-25個(gè)施氮水平，每個(gè)水平設(shè)2個(gè)重復(fù)。各處理的肥料均在冬小麥播前一次性施入，生育期不追肥，其他栽培管理措施同一般高產(chǎn)麥田。

樣品采集于冬小麥拔節(jié)期、抽穗期、開花期和灌漿期進(jìn)行。采樣時(shí)，每小區(qū)選取2個(gè)樣點(diǎn)，在樣點(diǎn)附近采摘10株植株冠層相同葉位(沿主莖自上而下第一片)的葉片，共摘取10片，用保鮮袋密封，裝入藍(lán)冰保溫箱，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行光譜及花青素含量定量研究。

1.2 花青素相對(duì)含量測定

Dualex Scientific+(Force-A，Orsay，法國)是一種新型便攜式植物葉片測定儀器，對(duì)植物葉片花青素進(jìn)行無損精準(zhǔn)測定[18]。測定時(shí)每個(gè)樣點(diǎn)從10片葉片中選擇新鮮葉片6片，從葉柄至葉尖分段測量6次，求平均值作為該葉片花青素含量，再將6片葉片值平均得該樣點(diǎn)葉片花青素相對(duì)含量。

1.3 葉片高光譜圖像獲取與處理

采用SVC HR-1024i 型全波段地物光譜儀進(jìn)行葉片高光譜反射率測量，測量波長范圍350～ 2 500 nm，光譜測定使用儀器內(nèi)置光源，為消除環(huán)境變化對(duì)儀器的影響，每隔0.5 h進(jìn)行一次參考板校正。測定時(shí)，對(duì)測定過花青素的6片冬小麥葉片，使用葉片夾夾住葉片，從葉柄至葉尖分段測量3次，取平均值為該葉片的光譜反射率，取6條光譜平均值作為該樣點(diǎn)的光譜反射率。利用SVC HR-1024i PC 儀器自帶軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并重采樣至1 nm。經(jīng)研究花青素對(duì)葉片光譜的響應(yīng)波段主要在可見光和紫外波段，因此本研究主要選擇350～1 000 nm波段進(jìn)行分析[19]。由于光譜儀采集的是離散的數(shù)據(jù)，故采用式(1)對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)計(jì)算。

(1)

式中，Ri為波長inm處的光譜反射率，R′是Ri的一階導(dǎo)數(shù)，λi為第i個(gè)通道的波長。

1.4 光譜指數(shù)選擇

本研究利用Matlab軟件計(jì)算350～1 000 nm波段范圍內(nèi)任意兩波段組合的3種光譜指數(shù)[20-23]，即差值指數(shù)(diffierence spectral index,DSI)、比值指數(shù)(ratio spectral index,RSI)和歸一化指數(shù)(normalized diffierence spectral index,NDSI)，并計(jì)算3種光譜指數(shù)與冬小麥葉片花青素相對(duì)含量的相關(guān)系數(shù)(r)，再利用Matlab制作3種光譜指數(shù)的相關(guān)性等勢(shì)圖，根據(jù)r絕對(duì)值最大原則，選取波段組合的光譜指數(shù)進(jìn)行花青素相對(duì)含量分析。

1.5 預(yù)測模型建立與優(yōu)化

對(duì)每個(gè)生育時(shí)期采集的122個(gè)樣本按花青素值進(jìn)行排序，采用分層抽樣的方法抽取92個(gè)作為建模樣本集，剩余30個(gè)作為檢驗(yàn)樣本集。利用JMP Trial 14軟件中的偏最小二乘(partial least squares，PLS)構(gòu)建模型。模型精度驗(yàn)證和預(yù)測能力評(píng)判采用決定系數(shù)(r2)和均方根誤差(RMSE)兩個(gè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)各生育時(shí)期不同模型的擬合和預(yù)測能力。r2越接近1，RMSE越小，表示模型擬合能力和預(yù)測能力越好[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬小麥葉片花青素含量及其光譜特征

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，冬小麥灌漿期葉片花青素平均含量明顯高于拔節(jié)期、抽穗期和開花期(表1)，其次是拔節(jié)期的花青素含量，其他兩個(gè)時(shí)期的花青素含量相近。

表1 冬小麥葉片花青素描述性統(tǒng)計(jì)Table 1 Descriptive statistics of anthocyanins in winter wheat leaves

在可見光范圍內(nèi)，冬小麥葉片反射光譜在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)基本一致(圖1左)。在550 nm波段附近形成反射峰，反射率峰值在0.16～0.2之間；在680～720 nm波段范圍，花青素反射率急劇升高，各時(shí)期最終在720～1 000 nm波段范圍形成一個(gè)反射率大于0.4的高反射平臺(tái)。在一階導(dǎo)數(shù)光譜中，紅邊波段得到顯著增強(qiáng)，其一階導(dǎo)數(shù)光譜是整個(gè)波段范圍的最大值(圖1右)。

圖1 不同生育時(shí)期冬小麥葉片光譜反射率和一階導(dǎo)數(shù)光譜

2.2 冬小麥葉片花青素含量的高光譜模型

2.2.1 基于敏感波段的冬小麥葉片花青素預(yù)測模型

經(jīng)對(duì)冬小麥花青素相對(duì)含量與光譜反射率進(jìn)行相關(guān)性分析，在可見光范圍內(nèi)，拔節(jié)期在400 nm波段左右二者呈顯著負(fù)相關(guān)，在550 nm波段附近呈極顯著正相關(guān)，其他波段的相關(guān)性較差；抽穗期、開花期和灌漿期在500～700 nm波段呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)最高分別為0.558 0、0.860 1和0.544 6，在近紅外光范圍內(nèi)開花期呈極顯著負(fù)相關(guān)，其他時(shí)期相關(guān)性均較低(圖2)。經(jīng)對(duì)冬小麥葉片花青素含量與一階導(dǎo)數(shù)光譜的相關(guān)性分析，各生育時(shí)期在480～550和680～700 nm波段范圍均呈顯著正相關(guān)，在550～670和700～760 nm波段附近均呈負(fù)相關(guān)，最高相關(guān)性出現(xiàn)在開花期的755 nm波段處，r達(dá)到-0.899 4。

其次，每篇開場白中都有一定的話題與己方立場相關(guān)。而且，辯手所提出的立場都是己方動(dòng)議的總體原因。Yoni Cohen-Idov用一個(gè)話題說明了己方立場：政府在公共場合設(shè)立監(jiān)控錄像的行為，“超越了其維護(hù)法律尊嚴(yán)和保障社會(huì)秩序的權(quán)利”，所以，我們提議取消這項(xiàng)政策。

圖2 冬小麥葉片花青素含量與原始光譜和一階導(dǎo)數(shù)光譜的相關(guān)性

根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)[21]，分別從原始光譜和一階導(dǎo)數(shù)光譜中選擇與花青素相關(guān)性最高的波段作為自變量，構(gòu)建葉片花青素一元回歸預(yù)測模型(表2)。通過比較發(fā)現(xiàn)，以拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期原始光譜敏感波段構(gòu)建的模型的擬合性均較低，其他模型決定系數(shù)r2均超過0.5。其中，開花期的一階導(dǎo)數(shù)光譜在預(yù)測集和驗(yàn)證集中，r2均最大(分別為0.852 4和0.901 6)，RMSE均最小(分別為 0.006 4和0.005 1)，說明利用一階導(dǎo)數(shù)光譜對(duì)該生育時(shí)期的葉片花青素預(yù)測效果較好。由于使用一階導(dǎo)數(shù)光譜敏感波段擬合的模型較簡單、方便和準(zhǔn)確，因此在精度許可的情況下，該方法可作為一種監(jiān)測花青素的快速方法。

表2 基于敏感波段的冬小麥葉片花青素含量預(yù)測模型Table 2 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on sensitive bands

2.2.2 基于光譜指數(shù)的冬小麥葉片花青素預(yù)測模型

利用Matlab軟件計(jì)算350～1 000 nm波段范圍內(nèi)任意兩波段組合的RSI、DSI、NDSI三種光譜指數(shù)，并計(jì)算3種光譜指數(shù)與冬小麥葉片花青素相對(duì)含量的相關(guān)系數(shù)(r)，同時(shí)采用Matlab制作3種光譜指數(shù)的相關(guān)等勢(shì)圖(以開花期為例)。從圖3可以看出，開花期的3種光譜指數(shù)均有r大于0.8的區(qū)域，表明這些波段組合而成的光譜指數(shù)與花青素含量密切相關(guān)，并且相關(guān)性較強(qiáng)的波段區(qū)域較為一致，約位于500～720 nm波段范圍，其中RSI的相關(guān)性最高，達(dá)到 0.934 5。其他生育時(shí)期與開花期趨勢(shì)變化具有相似性，相關(guān)性較強(qiáng)區(qū)域基本在500～720 nm波段。拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期相關(guān)性最強(qiáng)的指數(shù)分別為RSI、NDSI、RSI。

依據(jù)相關(guān)系數(shù)大小選擇3種光譜指數(shù)作為自變量(表3)，分別建立花青素含量一元預(yù)測模型(表4)。從表4可以看出，拔節(jié)期、開花期和灌漿期決定系數(shù)最高的為RSI模型，抽穗期為NDSI模型；在所有模型中，開花期RSI模型的決定系數(shù)最高(0.867 9)，RMSE最小(0.006 0)，說明以開花期RSI構(gòu)建的模型擬合性最好。

表3 對(duì)花青素敏感的光譜指數(shù)入選波段相關(guān)指數(shù)及公式Table 3 Selected bands, formulas and related indices for spectral indices sensitive to anthocyanins

表4 基于光譜指數(shù)的冬小麥葉片花青素含量預(yù)測模型Table 4 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on spectral index

2.2.3 基于PLS的冬小麥葉片花青素預(yù)測模型

用偏最小二乘法(PLS)[25]，選擇相關(guān)性較高的RSI、DSI、NDSI 3種光譜指數(shù)為自變量，構(gòu)建各生育時(shí)期冬小麥葉片花青素含量的多元預(yù)測模型(表5)。從表5可以看出，PLS模型相較于單指數(shù)模型，決定系數(shù)均變大，表明模型預(yù)測效果提升。其中，抽穗期模型的決定系數(shù)r2最高，為 0.880 4，RMSE為0.006 8；開花期r2為 0.875 9，RMSE為0.005 8。這說明兩個(gè)生育時(shí)期的模型均具有較高的擬合性。

表5 基于PLS冬小麥葉片花青素含量預(yù)測模型Table 5 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on PLS

對(duì)冬小麥葉片花青素含量的多元預(yù)測模型進(jìn)行檢驗(yàn)(圖4)表明，拔節(jié)、抽穗、開花和灌漿期的預(yù)測值與實(shí)測值之間高度相關(guān)，其中開花期的r2和RMSE分別最大和最小，分別為0.925 7和 0.004 8；抽穗期次之，r2為0.898 2，RMSE為 0.007 2，說明基于PLS建立的冬小麥葉片花青素含量預(yù)測模型中，開花期的模型最穩(wěn)定、精度最高，是監(jiān)測冬小麥葉片花青素含量的最優(yōu)模型。

圖4 基于PLS冬小麥葉片花青素含量預(yù)測模型精度檢驗(yàn)

3 討 論

本研究表明，在以原始光譜敏感波段為自變量構(gòu)建的各生育時(shí)期預(yù)測模型中，僅開花期模型的r2達(dá)到0.7，預(yù)測效果較好，敏感波段為547 nm，說明綠光波段是花青素含量的敏感波段，這與前人的研究結(jié)果基本一致；以一階導(dǎo)數(shù)光譜敏感波段為自變量構(gòu)建的各生育時(shí)期模型中，僅灌漿期模型的r2為0.3，其他生育時(shí)期模型精度均超過0.5，敏感波段分別為644、639和755 nm，均位于紅光范圍內(nèi)，可見紅光對(duì)植物體生長發(fā)育有重要影響，可以利用這一特征對(duì)小麥健康狀況進(jìn)行診斷。利用各生育時(shí)期冬小麥葉片一階導(dǎo)數(shù)光譜的敏感波段構(gòu)建花青素的一元預(yù)測模型，不但簡單方便，而且精度有很大提高，可以作為一種監(jiān)測花青素含量的快速方法。

在各光譜指數(shù)模型中，灌漿期模型的預(yù)測效果相較于原始光譜模型精度有所提高，但效果仍然較差，這是由于在灌漿期時(shí)，冬小麥體內(nèi)各色素轉(zhuǎn)化為植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)光的吸收和利用減弱，導(dǎo)致反射光譜異常，進(jìn)而影響模型的精度。在拔節(jié)期、抽穗期和開花期中，RSI和NDSI模型精度均高于DSI模型，有更好的預(yù)測效果，而在這3個(gè)生育時(shí)期的兩種光譜指數(shù)的入選波段中，均有來自紅光和近紅外光范圍的波段，這是因?yàn)橹参矬w對(duì)紅光具有強(qiáng)吸收作用，紅光的變化直接影響植物體生長，因此研究紅光和近紅外光對(duì)冬小麥生長發(fā)育階段的影響機(jī)制具有重要意義。

單一光譜指數(shù)往往只包含作物光譜的部分信息，用其構(gòu)成的模型的精度和穩(wěn)定性都難以得到保證，因此本研究構(gòu)建的PLS模型中，將3種光譜指數(shù)作為自變量建立多元估算模型，進(jìn)一步提高了花青素含量的預(yù)測精度，穩(wěn)定性也得到增強(qiáng)，能夠快速、無損檢測冬小麥生長狀況。

4 結(jié) 論

(1)各生育時(shí)期葉片光譜反射率變化趨勢(shì)相似，在550 nm處形成反射峰，在400 nm和680 nm處形成吸收谷，在680～720 nm波段內(nèi)反射率急劇升高，最終在720～1 000 nm波段形成高反射平臺(tái)。

(2)各生育時(shí)期模型中，開花期模型精度較高，表現(xiàn)穩(wěn)定，可作為預(yù)測冬小麥花青素的最佳生育時(shí)期；開花期PLS模型可作為預(yù)測冬小麥花青素的最優(yōu)模型。