洪偉鳴 左偉勇 宋亮 吉光杰 張曄 楊佳文 陳海峰

摘要?為了解華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的感染狀況，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）/聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法對(duì)2017—2018年在華東地區(qū)各大中小規(guī)模豬場(chǎng)采集的210份臨床樣品進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)（肺、脾、淋巴結(jié)等），并對(duì)分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）進(jìn)行測(cè)序，由于2017—2018年江蘇、安徽和福建一些中小養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生小規(guī)模的流產(chǎn)死胎，因此也對(duì)其他一些相關(guān)常見病毒[如豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）]進(jìn)行了檢測(cè)，以確定導(dǎo)致流產(chǎn)死胎的主要原因以及豬繁殖與呼吸綜合征的流行情況和流行毒株。結(jié)果表明：210份樣品中，PRRSV陽性樣品78份，陽性率為37.1%;PCV2陽性樣品189份，陽性率90.0%;PRV陽性樣品5份，陽性率2.4%;CSFV陽性樣品0份，陽性率0。在這些陽性樣品中，福建、浙江、上海、江蘇、安徽、江西和山東等地區(qū)抗原陽性率有所差別，但都以PRRSV和PCV2為主。通過此次調(diào)查了解了華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的基本流行情況，為今后豬繁殖與呼吸綜合征的防控提供了參考。

關(guān)鍵詞?豬繁殖與呼吸綜合征;流行病學(xué);陽性率

中圖分類號(hào)?S851.3?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2020）14-0092-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.025

Abstract?In order to obtain the infection status of porcine reproductive and respiratory syndrome in East China， we used RT-PCR/PCR method to detect pathogens in 210 clinical samples collected from large and medium-sized pig farms in East China during 2017-2018 （lung， spleen， lymph nodes，?etc?.， and sequenced the isolated PRRSV. Due to small-scale abortions in some small and medium-sized farms in Jiangsu， Anhui and Fujian during 2017-2018， we also have other related common viruses such as porcine circovirus type 2 （PCV2）， classical swine fever virus （CSFV）， and pseudorabies virus （PRV） were tested to determine the main causes of stillbirth in abortion and the prevalence and prevalence of porcine reproductive and respiratory syndrome. The results showed that among 210 samples， there were 78 positive samples with the positive rate of 37.1%; 189 PCV2 positive samples with the positive rate of 90.0%; 5 positive PRV samples with the positive rate of 2.4%; and CSFV positive sample was 0， the positive rate was 0. Among these positive samples， the positive rates of antigens in Fujian， Zhejiang， Shanghai， Jiangsu， Anhui， Jiangxi and Shandong were different， but they were mainly PRRSV and PCV2. Through this survey， we learned the basic epidemic situation of blue ear disease in East China， and provided references for the prevention and control of porcine reproductive and respiratory syndrome in pigs.

Key words?Porcine reproductive and respiratory syndrome;Epidemiology;Positive rate

繁殖障礙性疾病向來是危害養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)殺手，而其中又以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）為主。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱藍(lán)耳病，是一種免疫抑制病，豬是其唯一感染宿主，而且常常繼發(fā)其他病原感染，豬感染該病毒后2～14周均可通過接觸將病毒傳播給其他易感豬[1]。臨床表現(xiàn)主要是母豬繁殖障礙、仔豬斷奶前高死亡率、育成豬的呼吸道疾病三大癥狀，病理變化主要是無繼發(fā)感染的病例除淋巴結(jié)輕度或中度水腫外，無肉眼可見變化，呼吸系統(tǒng)主要是間質(zhì)型肺炎，有時(shí)有卡他性肺炎，若有繼發(fā)感染，則可出現(xiàn)如心包炎、胸膜炎、腹膜炎及腦膜炎等相應(yīng)的病理變化[2]。該病具有地方流行性特性，且會(huì)持續(xù)存在并感染豬群，各種日齡、品種的豬都可以感染此病毒，其中日齡或孕齡在1月以內(nèi)的仔豬和妊娠母豬是最易感豬群[3]。

為了解華東地區(qū)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的流行情況以及優(yōu)勢(shì)毒株，2017—2018年筆者聯(lián)系當(dāng)?shù)睾献鲉挝?，共采集臨床樣品210份（肺、脾、淋巴結(jié)等），同時(shí)江蘇、安徽和福建一些中小養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)小規(guī)模的流產(chǎn)死胎情況，因此筆者利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）/聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，并對(duì)分離的PRRSV進(jìn)行了測(cè)序。

1?材料與方法

1.1?樣品

2017—2018年，從上海、江蘇、浙江、安徽、江西、山東、福建等地的規(guī)?；i場(chǎng)采集210份臨床樣品（肺、脾、淋巴結(jié)等），于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×GC rich PCR MasterMix（KT206）、Marker DL600、DL2000均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;無水乙醇、氯仿、異丙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.3?引物設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[4-7]設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物科技有限公司合成，豬瘟病毒序列采用套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列以及擴(kuò)增片段大小見表1。

1.4?樣品處理?取0.3 g樣品，在1.5 mL EP管內(nèi)剪碎并加入600 μL冰凍PBS緩沖液，然后用勻漿儀高速勻漿;-20 ℃下反復(fù)凍融3次，12 000 r/min在4 ℃下離心5 min，取上清備用。

1.5?病毒RNA/DNA的提取與檢測(cè)

根據(jù)TIANGEN公司病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取病毒RNA或DNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA或DNA為模板，分別擴(kuò)增PRRSV、PRV、CSFV、PCV2。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。最后的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2?結(jié)果與分析

2.1?PRRSV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

從210份臨床樣品中檢測(cè)出78份陽性，平均陽性率為37.1%。其中上海地區(qū)樣品陽性率為25.0%、江蘇地區(qū)樣品陽性率為35.0%、浙江地區(qū)樣品陽性率為25.0%、安徽地區(qū)樣品陽性率為90.0%、江西地區(qū)樣品陽性率為18.5%、山東地區(qū)樣品陽性率為14.8%、福建地區(qū)樣品陽性率為56.2%，詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.2?PCV2 PCR檢測(cè)結(jié)果

從210份臨床樣品中檢測(cè)出189份陽性，平均陽性率為90.0%。其中，上海地區(qū)樣品陽性率為89.3%、江蘇地區(qū)樣品陽性率為90.0%、浙江地區(qū)樣品陽性率為90.6%、安徽地區(qū)樣品陽性率為90.0%、江西地區(qū)樣品陽性率為92.6%、山東地區(qū)樣品陽性率為88.9%、福建地區(qū)樣品陽性率為87.5%，詳細(xì)結(jié)果見表3。

2.3?PRV PCR檢測(cè)結(jié)果

從210份臨床樣品中檢測(cè)出5份陽性，平均陽性率為2.4%。5份陽性樣品均是在安徽地區(qū)發(fā)現(xiàn)的，其余地區(qū)均未檢出，詳細(xì)結(jié)果見表4。

3?結(jié)論與討論

該試驗(yàn)主要針對(duì)華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的流行規(guī)律以及優(yōu)勢(shì)毒株開展，目的是對(duì)華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的流行規(guī)律以及優(yōu)勢(shì)毒株有所了解，并通過此次調(diào)查制定針對(duì)性防制措施。由于在此期間有些地區(qū)發(fā)生了小規(guī)模的母豬流產(chǎn)和死胎情況，因此對(duì)一些常見的引起母豬流產(chǎn)死胎的病毒性疾病CSFV、PRV進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)由于PCV2屬于免疫抑制性疾病，可以與豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬等混合感染，特對(duì)PCV2也進(jìn)行了檢測(cè)。

該試驗(yàn)對(duì)從華東地區(qū)等地大中小規(guī)模豬場(chǎng)采集的210份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示PRRSV陽性率37.1%，PCV2陽性率90%，PRV陽性率2.4%，且均在安徽地區(qū)發(fā)現(xiàn)，各地均未檢測(cè)出豬瘟陽性;在上海、江蘇、浙江、安徽、江西、山東、福建均存在不同程度的PRRSV感染，PRRSV陽性率與國(guó)內(nèi)其他研究結(jié)果相符;PCV2幾乎在每個(gè)豬場(chǎng)都存在，且陽性率較高，這與祝衛(wèi)國(guó)[8]對(duì)PCV2的研究結(jié)果相符。這也說明可能是PRRSV與PCV2或者PRV混合感染造成的流產(chǎn)。

韋正吉等[9]在2008—2010年共從桂中地區(qū)采集221份臨床病料，通過RT-PCR方法對(duì)PRRSV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示高致病性PRRSV陽性率為37.56%，經(jīng)典PRRSV陽性率為7.24%。朱麗等[10]在2017年對(duì)云南部分地區(qū)豬場(chǎng)PRRSV感染情況進(jìn)行調(diào)查，分別檢測(cè)了PRRSV抗體和抗原，結(jié)果顯示PRRSV抗體陽性率為73.56%，抗原陽性率為18.31%;同時(shí)筆者還對(duì)豬瘟病毒、偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原抗體進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明這3種病毒均被檢測(cè)到，說明也存在混合感染情況，而且PRRSV和PCV2陽性率最高。馬振乾等[11]對(duì)我國(guó)2017年上半年4種豬常見疾病流行特點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)分析，共檢測(cè)了8 091份血清和415份病料，結(jié)果顯示PRRSV抗體陽性率為85.04%，抗原陽性率為27.56%，也說明了我國(guó)一直都存在著PRRSV感染情況。在該試驗(yàn)中PCV2抗原檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他研究，有可能是采集樣本的豬場(chǎng)有部分發(fā)病以及用來采集樣本的豬群圓環(huán)病毒病感染率高但并未表現(xiàn)出明顯病變。

這些研究表明，我國(guó)華東地區(qū)普遍存在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征感染，但各地區(qū)感染率有所差別，而且存在與PCV2或者PRV以及其他病原體混合感染的情況。針對(duì)2017—2018年華東部分地區(qū)豬場(chǎng)主要疫病的監(jiān)測(cè)結(jié)果，確定存在豬偽狂犬病散發(fā)，豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病感染率增高的情況;應(yīng)加強(qiáng)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病的防控，加強(qiáng)豬偽狂犬病的凈化。不同豬場(chǎng)應(yīng)該結(jié)合豬場(chǎng)的實(shí)際情況加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，選擇適合的疫苗并制訂適合自己豬場(chǎng)的免疫程序，防控主要疫病的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

[1]鮑海梅.高致病性豬藍(lán)耳病的預(yù)防對(duì)策[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2018（11）：81.

[2]蘆先英，許豆艷，郭金生，等.高致病性豬藍(lán)耳病的診斷及防控措施[J].畜禽業(yè)，2016（11）：9-10.

[3]譚偉，鄧顯文，謝芝勛.豬繁殖與呼吸綜合征病毒及疫苗的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（6）：240-247.

[4]ZHANG L J，F(xiàn)ENG Y，MARTIN D P，et al.Genetic diversity and phylogenetic analysis of the ORF5 gene of PRRSV from central China[J].Research in veterinary science，2017，115：226-234.

[5]施研進(jìn)，楊蓓，屈勇剛，等.新疆北疆部分地區(qū)PCV2的PCR檢測(cè)及基因型分析[J].中國(guó)豬業(yè)，2014，9（3）：32-34.

[6]劉中原，劉石，徐衛(wèi)松，等.利用PCR技術(shù)對(duì)豬偽狂犬疫苗含毒量的評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（4）：475-477.

[7]劉梅芬，王淑娟，閆若潛，等.豬瘟病毒巢式RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43（9）：2285-2290.

[8]祝衛(wèi)國(guó).豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[9]韋正吉，黃溢泓，嚴(yán)斯剛，等.桂中地區(qū)2008-2010年豬瘟及豬繁殖與呼吸綜合征的流行病學(xué)調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2011（9）：101-102.

[10]朱麗，蘇琳琳，呂念詞，等.2017年云南地區(qū)部分豬場(chǎng)主要疫病病原及血清學(xué)檢測(cè)與分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（22）：80-83，247.

[11]馬振乾，楊旭兵，劉曉東，等.2017年上半年我國(guó)4種常見豬病流行特點(diǎn)分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（18）：97-99.