薛宇昂，郭 壯，趙慧君，張振東，雷 敏*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽 441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003）

石花酒是用高粱、糯米為原料，以豌豆、大麥制曲，進(jìn)行地缸發(fā)酵、分段取酒，最后勾兌而成的清香型白酒，是湖北省名酒之一。大曲中豐富的微生物菌落是酒體風(fēng)味品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素。近年來，研究人員對(duì)全國(guó)各類大曲中微生物多樣性展開了廣泛的研究。劉桂君等[1]從牛欄山酒廠清香型大曲和酒醅中分離出23株芽孢桿菌，通過生理生化試驗(yàn)鑒定12株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；李增勝[2]研究發(fā)現(xiàn)，汾酒酒醅中的酵母菌以酵母菌屬（Saccharomyces）為主，其產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)，其次是具有一定產(chǎn)香和產(chǎn)酒精能力的漢遜酵母（Hansenula）和假絲酵母（Candida）及產(chǎn)酒精不強(qiáng)的擬內(nèi)孢霉（Endomycopsis），還有極少量的畢赤酵母（Pichia）等產(chǎn)膜酵母；蘭玉倩等[3]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）指紋技術(shù)分析了清香型大曲在生產(chǎn)過程中酵母類微生物的演替規(guī)律。共檢測(cè)到伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢氏酵母（Pichia）、酵母菌屬（Saccharomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、地霉屬（Geotrichum）和根霉屬（Rhizopus）6個(gè)真菌微生物屬，其中東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）在大曲整個(gè)生產(chǎn)過程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；王彩虹[4]采用克隆文庫技術(shù)與PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）技術(shù)相結(jié)合的手段研究發(fā)現(xiàn)，3種汾酒清香型大曲中細(xì)菌均分布于芽孢桿菌綱（Bacillibacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）及變形菌綱（Alphaproteobacteria），且3種大曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群均含有乳桿菌屬。以上研究成果為酒曲中優(yōu)勢(shì)菌種的開發(fā)及進(jìn)一步深入研究的開展奠定了良好的基礎(chǔ)。石花酒大曲（以下簡(jiǎn)稱石花大曲）中微生物豐富，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，然而目前未有關(guān)于石花大曲微生物多樣性研究的報(bào)道。

下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）一方面可快速準(zhǔn)確地提供高通量測(cè)序信息，另一方面可為分析提供定位結(jié)果[5]，其中Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)研究中。HU X L等[6]使用Illumina MiSeq對(duì)濃香型白酒窖泥微生物信息進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，窖泥微生物群落與窖泥品質(zhì)和環(huán)境因素有關(guān)。YANG H Y等[7]根據(jù)Illumina MiSeq測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，東北地區(qū)酸菜發(fā)酵的過程中出現(xiàn)了硬桿菌、變形桿菌、擬桿菌、放線菌、藍(lán)藻、梭桿菌和疣菌，以及其他未分類的細(xì)菌；沈馨等[8]利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，孝感地區(qū)3個(gè)鳳窩酒曲共有大量的核心細(xì)菌菌群；POLKA J等[9]利用Illumina MiSeq測(cè)序在意大利蒜味咸腸中鑒定出32種不同的葡萄球菌和33種乳酸桿菌，其中23個(gè)存在于至少10%的調(diào)查樣品中。綜上，Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)能夠更準(zhǔn)確全面地獲取樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)信息。

本研究以采集自湖北襄陽市石花酒廠的石花大曲為研究對(duì)象，提取樣品宏基因組，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其微生物多樣性進(jìn)行解析，以期為石花大曲中微生物資源的開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

石花大曲：襄陽石花酒廠；采集自湖北襄陽市石花酒廠，4個(gè)樣品分別命名為SHQ01、SHQ02、SHQ03、SHQ04。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）Mix、5×TransStartTM、FastPfu Buffer和FastPfu Fly脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）Polymerase（5 U/μL）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；10×PCR Buffer、Solution I、pMD18-T vector、蛋白酶K（20 U/μg）、溶菌酶（400 U/μg）：寶生物工程（大連）有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉、氯仿、十六烷基三甲基溴化銨、異丙醇、乙醇、三輕甲基氨基甲烷、酚、異戊醇、氯化鈉和乙酸鈉等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)NanoDrop公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司；Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司；Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；2100芯片生物分析儀：美國(guó)Agilent公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將采集到的石花大曲樣品置于有干冰的采樣箱中于24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，使用潔凈無菌的研缽研成粉末后使用。

1.3.2 石花大曲中微生物宏基因組DNA提取

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取石花大曲樣品中的微生物總DNA，并用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA純度及濃度，以此獲得高品質(zhì)和高濃度的微生物宏基因組DNA。

1.3.3 細(xì)菌和真菌PCR擴(kuò)增

按文獻(xiàn)[10]所述方法對(duì)樣品中細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按文獻(xiàn)[11]所述方法對(duì)樣品中真菌18SrRNA的V4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[12]，利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒將其回收并送樣至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumian MiSeq高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumian MiSeq PE300。

1.3.4 序列的拼接及質(zhì)控

按照文獻(xiàn)[13]所述的方法進(jìn)行序列拼接，按照序列間的重疊關(guān)系對(duì)Illumian MiSeq PE300平臺(tái)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，在拼接過程中要求重疊區(qū)的堿基數(shù)≥10 bp或最大錯(cuò)配比率≤0.2，同時(shí)要求引物堿基錯(cuò)配數(shù)≤2 bp，且切除引物后序列的長(zhǎng)度＞50 bp，若序列不符合上述條件則予以剔除。

1.3.5 生物信息統(tǒng)計(jì)與分析

使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）平臺(tái)[14]進(jìn)行物種鑒定和相對(duì)含量的分析；使用PyNAST工具[15]校準(zhǔn)并排齊序列；使用UCLUST算法[16]分別以100%和97%的相似度進(jìn)行序列劃分并建立操作分類單元（opera tionaltaxonomicunits，OTU），從每個(gè)OTU中選出代表性序列，分別整合核糖體數(shù)據(jù)庫（ribosomal database project，RDP）[17]、Greengenes[18]和SILVA數(shù)據(jù)庫[19]，對(duì)OTU進(jìn)行序列同源性比對(duì)和種屬分類學(xué)鑒定，從而分別明確石花大曲中細(xì)菌和真菌的相關(guān)信息。利用觀察物種（Observed Species）指數(shù)、超1（Chao 1）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)等評(píng)價(jià)微生物菌群的豐度和多樣性[20]。

1.3.6 圖像繪制與數(shù)據(jù)處理

使用Matlab2016b軟件進(jìn)行熱圖的繪制，其他圖由Origin 8.5軟件繪制。相關(guān)性由SAS V8軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石花大曲樣品細(xì)菌序列豐富度分析

使用Illumian MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4個(gè)石花大曲樣品的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，其16S rRNA測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)見表1。其中Observed Species指數(shù)和Chao 1指數(shù)是估算樣品中含有物種數(shù)目及所含OTU數(shù)目的指數(shù)，兩者均能反映樣品的物種豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用來表現(xiàn)樣品中物種的豐富度和均勻度，兩者均能反映樣品的物種多樣性。

表1 石花酒大曲樣品中細(xì)菌的測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)Table 1 Sequencing results and diversity index of bacteria in Shihua Baijiu Daqu samples

由表1可知，4個(gè)石花大曲樣品中共產(chǎn)生246 873條細(xì)菌序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生61 718條序列。根據(jù)97%相似性歸類共得到8 180個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品2 045個(gè)OTU。當(dāng)測(cè)序量為54 010時(shí)，樣品SHQ04的Observed Species指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均為各樣品中的最大值，分別為1 189、1 257、6.27和0.96，表明樣品SHQ04中細(xì)菌群落豐富度和多樣性均為最高；樣品SHQ02的Observed Species指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均為最小，分別為779、912、3.80和0.74，表明樣品SHQ02中細(xì)菌群落豐富度和多樣性均為最低。

2.2 基于門和屬水平的細(xì)菌多樣性分析

圖1 基于細(xì)菌門（A）和屬（B）水平石花酒大曲樣品中細(xì)菌多樣性分析Fig.1 Analysis of bacteria diversity in Shihua Baijiu Daqu samples based on the phylum (A) and genus (B) level

從每個(gè)OTU中挑選一條代表性序列進(jìn)行比對(duì)，然后統(tǒng)計(jì)其界、門、綱、目、科和屬的種類和數(shù)量，其中細(xì)菌門及屬的分析結(jié)果見圖1，將相對(duì)含量＜0.1%的細(xì)菌門或相對(duì)含量＜0.1%的細(xì)菌屬歸為其他，相對(duì)含量＞0.1%的細(xì)菌門或相對(duì)含量＞1%的細(xì)菌屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門或?qū)佟?/p>

由圖1A可知，4個(gè)石花大曲樣品中共檢測(cè)出17個(gè)細(xì)菌門，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對(duì)含量分別為61.33%、32.25%、5.04%，且平均僅有0.1%的菌株不能鑒定到門水平。樣品中變形桿菌門和厚壁菌門的累積平均相對(duì)含量高達(dá)93.58%，而放線菌門平均相對(duì)含量＜5.04%。樣品SHQ04中變形桿菌門的相對(duì)含量明顯低于其他樣品，而樣品SHQ02中厚壁菌門含量亦明顯低于其他樣品，說明各樣品中細(xì)菌門的種類和含量存在差異。

由圖1B可知，4個(gè)石花大曲樣品中共檢測(cè)出168個(gè)細(xì)菌屬，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和Kroppenstedtia，平均相對(duì)含量分別為58.97%、12.98%、12.86%、3.71%、1.83%、1.27%和1.25%，所有合格序列僅有1.70%不能鑒定到屬水平。值得一提的是，假單胞菌屬在樣品SHQ04中的相對(duì)含量?jī)H有6.51%，而在樣品SHQ02中的相對(duì)含量高達(dá)95.33%；乳桿菌屬在樣品SHQ04中的相對(duì)含量為47.88%，而在樣品SHQ01、SHQ02和SHQ03中的相對(duì)含量分別為3.37%，0.07%和0.13%；明串珠菌屬僅在樣品SHQ1和SHQ4中含有。由此可見，雖然石花大曲樣品中含有大量細(xì)菌菌群，但這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在各樣品中并非均勻分布。陳申習(xí)等[21]采用傳統(tǒng)分離方法和現(xiàn)代分子技術(shù)對(duì)清香型小曲白酒機(jī)械化生產(chǎn)中微生物動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酒醅微生物的細(xì)菌主要為乳桿菌屬和芽孢桿菌屬。也有研究人員采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型白酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析。張雙燕等[22]利用高通量測(cè)序方法對(duì)北京某清香型酒廠大曲細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門；乳桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Factococcus）、明串珠菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬；王雪山等[23]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同位置酒醅中微生物種群結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)清香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、Kroppenstedtia、假單胞菌屬、明串珠菌屬、芽孢桿菌屬和片球菌屬。上述結(jié)論中均有優(yōu)勢(shì)屬乳桿菌屬，其他屬在結(jié)論中也有重復(fù)出現(xiàn)，結(jié)論中略微不同的原因可能是與使用原料、制作環(huán)境或制作工藝有關(guān)。

2.3 基于OTU水平的細(xì)菌多樣性分析

4個(gè)石花大曲樣品中的OTU數(shù)量及種類并非完全相同，其中平均相對(duì)含量＞1%的OTU有9個(gè)，其在各石花大曲樣品中的相對(duì)含量見圖2。

圖2 石花酒大曲樣品中平均相對(duì)含量＞1%細(xì)菌OTU統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Statistical analysis of OTU of bacteria with mean relative content more than 1% in Shihua Baijiu Daqu samples

由圖2可知，平均相對(duì)含量＞1%的OTU（平均相對(duì)含量）分別為OTU5 932（29.43%）、OTU9（11.79%）、OTU1 837（10.63%）、OTU6 068（3.49%）、OTU5 659（2.60%）、OTU3 353（2.29%）、OTU4 058（1.22%）、OTU895（1.10%）和OTU5 687（1.05%），其中OTU5 932、OTU9、OTU895和OTU5 687隸屬于變形桿菌門，OTU1837、OTU6068和OTU5659隸屬于厚壁菌門，OTU3353和OTU4058隸屬于放線菌門，且除OTU4058，其他OTU在各樣品中均存在。由圖2亦可知，樣品SHQ2中OTU5 932的相對(duì)含量已達(dá)65.15%，顯著高于其他樣品，而其OTU2 793的相對(duì)含量?jī)H為2.09%，樣品SHQ4中OTU6 068的相對(duì)含量已達(dá)32.25%，顯著高于其他樣品，且OTU4 058僅在樣品SHQ4中出現(xiàn)。在每個(gè)樣品中均出現(xiàn)的細(xì)菌門為樣品的核心細(xì)菌門。由此可見，石花大曲樣品中的核心細(xì)菌門為變形桿菌門、厚壁菌門和放線菌門，且各樣品相對(duì)含量存在差異。

2.4 石花大曲樣品真菌序列豐富度分析

使用Illumian MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4個(gè)石花大曲樣品的真菌多樣性進(jìn)行分析，其18S rRNA測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)見表2。

由表2可知，4個(gè)石花大曲樣品中共產(chǎn)生179 736條真菌序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生44 934條序列。根據(jù)97%相似性歸類共得到4 640個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品1 160個(gè)OTU。當(dāng)測(cè)序量為42010時(shí)，樣品SHQ02的ObservedSpecies指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均為各樣品中的最大值，分別為1 275、5 478、4.69和0.90，表明樣品SHQ02中真菌群落豐富度和多樣性均最大；樣品SHQ01的Observed Species指數(shù)和Chao 1指數(shù)最小，分別為1 000和3 083，樣品SHQ04的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)最小，分別為2.93和0.51。表明樣品SHQ01中真菌群落豐富度最低，SHQ04多樣性最低。

表2 石花酒大曲樣品中真菌的測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)Table 2 Sequencing results and diversity index of fungi in Shihua Baijiu Daqu samples

2.5 基于門和屬水平的真菌多樣性分析

從每個(gè)OTU中挑選一條代表性序列進(jìn)行比對(duì)，然后統(tǒng)計(jì)其界、門、綱、目、科和屬的種類和數(shù)量，其中真菌門及屬水平的分析結(jié)果見圖3，將相對(duì)含量＜0.1%的真菌門或相對(duì)含量＞1%的真菌屬歸為其他，相對(duì)含量＞0.1%的真菌門或相對(duì)含量＞1%的真菌屬定義為優(yōu)勢(shì)真菌門或?qū)佟?/p>

由圖3A可知，4個(gè)石花大曲樣品中主共檢測(cè)出3個(gè)真菌門，其中優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota）、其他的真菌門有擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和Mucoromycota，平均相對(duì)含量分別為99.70%、0.17%、0.12%，且平均僅有0.01%不能鑒定到門水平。樣品中子囊菌門的平均相對(duì)含量高達(dá)99.70%，而擔(dān)子菌門和Mucoromycota的累計(jì)平均相對(duì)含量＜0.29%。樣品SHQ04中擔(dān)子菌門和Mucoromycota的相對(duì)含量明顯低于其他樣品，而樣品SHQ02中子囊菌門含量低于其他樣品，說明各樣品中真菌門的種類和含量存在差異。

由圖3B可知，4個(gè)樣品中共檢測(cè)出25個(gè)真菌屬，其中優(yōu)勢(shì)真菌屬為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅曲菌屬（Monascus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和Leiothecium，平均相對(duì)含量分別為57.08%、17.58%、5.38%、4.76%、1.78%和1.22%，所有合格序列有8.47%不能鑒定到屬水平。值得一提的是，復(fù)膜孢酵母屬在樣品SHQ02中的相對(duì)含量?jī)H有21.25%，而在樣品SHQ04中的相對(duì)含量高達(dá)88.39%；青霉菌屬在樣品SHQ02中的相對(duì)含量為18.58%，而在樣品SHQ01、SHQ03和SHQ04中的相對(duì)含量分別為0.13%、0.34%和0.01%；紅曲菌屬在樣品SHQ4中僅含有0.04%。由此可見，雖然石花大曲樣品中含有大量真菌菌群，但這些優(yōu)勢(shì)真菌在各樣品中并非均勻分布。王雪山等[23]通過高通量測(cè)序技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，在清香型白酒發(fā)酵過程中，真菌種群中子囊菌門在所有酒醅中占主導(dǎo)地位；優(yōu)勢(shì)真菌屬包括畢赤酵母屬、假絲酵母屬、曲霉屬、復(fù)膜孢酵母屬和Kazachstania；雷振河[24]應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構(gòu)成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大曲中優(yōu)勢(shì)真核微生物主要包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母屬。上述結(jié)論中的真菌優(yōu)勢(shì)屬間均有相似之處，但結(jié)論中卻沒有出現(xiàn)一個(gè)共有的優(yōu)勢(shì)真菌屬。出現(xiàn)這一結(jié)果這可能是由于原料、地域、環(huán)境、發(fā)酵工藝等因素不同造成的。

圖3 基于真菌門（A）和屬（B）水平石花酒大曲樣品中細(xì)菌多樣性分析Fig.3 Analysis of fungal diversity in Shihua Baijiu Daqu samples based on the phylum (A) and genus (B) level

2.6 基于OTU水平的真菌多樣性分析

4個(gè)石花大曲樣品中的OTU數(shù)量及種類并非完全相同，其中平均相對(duì)含量＞1%的OTU有7個(gè)，其在各石花大曲樣品中的相對(duì)含量見圖4。

圖4 石花酒大曲樣品中平均相對(duì)含量＞1%真菌OTU統(tǒng)計(jì)分析Fig.4 Statistical analysis of OTU of fungi with mean relative abundance more than 1%in Shihua Baijiu Daqu samples

由圖4可知，平均相對(duì)含量＞1%的OTU（平均相對(duì)含量）分別為OTU2 668（43.97%）、OTU1 186（14.50%）、OTU65（5.04%）、OTU790（3.74%）、OTU1 246（1.42%）、OTU2 387（1.34%）和OTU3 135（1.00%），OTU均屬于子囊菌門，且這些OTU在各樣品中均存在。由圖4亦可知，各樣品中所有相對(duì)含量＞1%的OTU的平均累計(jì)相對(duì)含量已達(dá)71.03%。在每個(gè)樣品中均出現(xiàn)的真菌門為樣品的核心真菌門。由此可見，石花大曲樣品中的核心真菌門為子囊菌門，且各樣品相對(duì)含量存在差異。

2.7 石花大曲真菌與細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的相關(guān)性分析

采用SAS V8軟件對(duì)4個(gè)石花大曲樣品中的真菌和細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬進(jìn)行初步的相關(guān)性分析，結(jié)果見圖5。

圖5 石花酒大曲優(yōu)勢(shì)真菌屬與細(xì)菌屬相關(guān)性分析熱圖Fig.5 Heat map of relativity analysis of dominant fungi and bacteria genera in Shihua Baijiu Daqu

由圖5可知，假單胞菌屬和曲霉屬呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），R=0.96，而其他真菌與細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬之間相關(guān)性均不顯著（P＞0.05），且部分呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。說明假單胞菌屬細(xì)菌和曲霉屬真菌在石花大曲中有著相互促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，而其他屬的細(xì)菌與真菌相互促進(jìn)作用不明顯，有的甚至相互抑制生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本研究使用IlluminaMiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，以16SrRNA的V3-V4區(qū)和18S rRNA的V4-V5區(qū)為測(cè)序靶點(diǎn)，對(duì)石花大曲中的細(xì)菌和真菌微生物多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石花大曲中的細(xì)菌主要由隸屬于變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和Kroppenstedtia的7個(gè)屬組成；石花大曲中的真菌主要由隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和Mucoromycota的復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅曲菌屬（Monascus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和Leiothecium6個(gè)屬組成，且石花酒曲樣品共有大量的核心細(xì)菌和真菌菌群。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的假單胞菌屬與真菌的曲霉屬有顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）。該研究為石花大曲中微生物資源的開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。