豐磊，張婷，張金金，趙嵐

作者單位：1南陽(yáng)油田總醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 南陽(yáng) 473132；2南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 南陽(yáng) 473000

動(dòng)脈粥樣硬化是2型糖尿病病人常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是增加心肌梗死、腦梗死等疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。內(nèi)皮細(xì)胞位于血管最內(nèi)層、是血管與血液循環(huán)之間的第一道防線(xiàn)，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是糖尿病病人發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理環(huán)節(jié)，針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)行干預(yù)是防治糖尿病病人動(dòng)脈粥樣硬化的有效靶點(diǎn)［1-2］。西格列汀是近年來(lái)廣泛用于降糖治療的二肽基肽酶4（DPP4）抑制劑，通過(guò)抑制DPP4活性、增加胰高血糖素樣肽-1的含量來(lái)起到降糖作用［3］。已有研究報(bào)道，西格列汀能夠在高糖環(huán)境下增加內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)［4］，提示西格列汀可能在高糖環(huán)境下發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用，但具體的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制尚未明確。為此，本研究自2018年4月至2019年4月以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）為對(duì)象，分析了西格列汀對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs凋亡的改善作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細(xì)胞 HUVECs細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心，在液氮中冷凍保存。

1.1.2 試劑 西格列汀購(gòu)自默沙東公司，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002購(gòu)自Sigma公司，TUNEL凋亡染色試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，B細(xì)胞淋巴瘤∕白血病-2（Bcl-2）、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、PI3K、AKT、人磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的單克隆一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.1.3 儀器 熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon公司，化學(xué)顯影儀購(gòu)自Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1 HUVECs培養(yǎng)、分組及給藥 HUVECs用含有10%胎牛血清、100 U∕mL青霉素、100 μg∕mL鏈霉素的DMEM進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代接種在培養(yǎng)板內(nèi)并分組。對(duì)照組用含有5.5 mmol∕L葡萄糖的DMEM處理，高糖組用含有33.3 mmol∕L葡萄糖的DMEM處理，西格列汀組在33.3 mmol∕L高糖的基礎(chǔ)上參照戴堯［3］的研究、用含有20 μmol∕L西格列汀的DMEM處理，西格列汀+LY組用含有33.3 mmol∕L 葡萄糖、20 μmol∕L西格列汀、10 μmol∕L LY294002的DMEM處理，每個(gè)條件設(shè)5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)處理24 h。

1.2.2 HUVECs凋亡檢測(cè) HUVECs接種在24孔板內(nèi)，分組給藥24 h后用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色，抗熒光猝滅封固液封固后在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)綠色熒光的細(xì)胞和藍(lán)色熒光的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算兩者比值為細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 HUVECs中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT表達(dá)檢測(cè) HUVECs接種在6孔板內(nèi)，分組給藥24 h后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞、提取蛋白，BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量后取30 μg蛋白樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)，將蛋白樣本加入SDS-PAGE中，電泳后電轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉NC膜1 h，用Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的單克隆一抗在4℃孵育NC膜過(guò)夜。次日，用HRP標(biāo)記的二抗在室溫孵育NC膜1 h，最后加入ECL顯影液、在化學(xué)顯影儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件錄入數(shù)據(jù)，四組間計(jì)量資料的采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1西格列汀對(duì)高糖條件下HUVECs凋亡的影響與對(duì)照組比較，高糖組HUVECs的凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，西格列汀組HUVECs的凋亡率明顯減少（P＜0.05）；與西格列汀組比較，西格列汀+LY組的凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2西格列汀對(duì)高糖條件下HUVECs中凋亡基因表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，高糖組HUVECs中Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯減少，Cleaved-caspase-9、Cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，西格列汀組HUVECs中Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯增加，Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）；與西格列汀組比較，西格列汀+LY組HUVECs中Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯減少，Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖2，表1。

2.3西格列汀對(duì)高糖條件下HUVECs中PI3K/AKT通路的影響與對(duì)照組比較，高糖組HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）；與高糖組比較，西格列汀組HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）；與西格列汀組比較，西格列汀+LY組HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖3，表2。

圖1 四組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）凋亡率的比較（熒光染色×100）

圖2 四組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白條帶

表1 四組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的比較∕M（P25，P75）

圖3 四組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中p-PI3K、p-AKT的蛋白條帶

表2 四組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的比較∕M（P25，P75）

3 討論

近年來(lái)，2型糖尿病的發(fā)病率呈不斷升高的趨勢(shì)，相應(yīng)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病人數(shù)也不斷增多，嚴(yán)重危害國(guó)民的生命健康［5］。動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病常見(jiàn)的血管并發(fā)癥，以動(dòng)脈粥樣斑塊形成為基本特征，可增加心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是造成動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素，糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與持續(xù)高糖環(huán)境的刺激有關(guān)［6］。多項(xiàng)研究證實(shí)，高糖條件能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡［7-9］，這也是高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞損傷的可能途徑。本實(shí)驗(yàn)以HUVECs為對(duì)象、用高糖條件刺激后得到了與既往其他報(bào)道一致的結(jié)果，即高糖組HUVECs的凋亡率明顯高于對(duì)照組。因此，抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡也被越來(lái)越多的學(xué)者視為防治糖尿病血管并發(fā)癥的靶點(diǎn)。

西格列汀是一類(lèi)二肽基肽酶4抑制劑，通過(guò)抑制二肽基肽酶4對(duì)胰高血糖素樣肽-1的降解來(lái)增加體內(nèi)胰高血糖素樣肽-1的水平，進(jìn)而通過(guò)胰高血糖素樣肽-1的生物學(xué)活性來(lái)起到降糖作用。新近的多項(xiàng)研究報(bào)道，胰高血糖素樣肽-1具有內(nèi)皮保護(hù)作用［10-11］；國(guó)內(nèi)戴堯的研究證實(shí)，西格列汀能夠在高糖環(huán)境下增加內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)［4］，提示西格列汀可能也具有內(nèi)皮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)在高糖條件下用西格列汀對(duì)HUVECs進(jìn)行干預(yù)，觀察凋亡率發(fā)現(xiàn)：西格列汀組HUVECs的凋亡率明顯低于高糖組，說(shuō)明西格列汀能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡、具有內(nèi)皮細(xì)胞作用。

線(xiàn)粒體途徑凋亡是目前已知在高糖環(huán)節(jié)下與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的凋亡機(jī)制，Bcl-2基因是調(diào)控該凋亡途徑的關(guān)鍵基因［12-13］。Bcl-2基因的編碼產(chǎn)物定位于線(xiàn)粒體外膜，能夠抑制線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)的釋放；進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素C能夠使pro-caspase-9裂解為有活性的cleaved-caspase-9，后者通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)使pro-caspase-3裂解為有活性的cleaved-caspase-3、進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放來(lái)起到抗凋亡作用［14-15］。在本研究中，高糖刺激后HUVECs中Bcl-2的表達(dá)減少，cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表達(dá)增多；在用西格列汀處理后，HUVECs中Bcl-2的表達(dá)增多，cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表達(dá)減少，與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)西格列汀能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡。

在明確西格列汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡具有抑制作用后，本研究進(jìn)一步分析了西格列汀發(fā)揮該作用的分子機(jī)制。PI3K∕AKT通路是具有促增殖、抗凋亡作用的信號(hào)通路，PI3K及AKT以磷酸化的形式發(fā)生活化后能夠調(diào)節(jié)下游Bcl-2、4EBP1等基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡［16-17］。本實(shí)驗(yàn)的分析證實(shí)，高糖組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯減少，西格列汀干預(yù)后細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯增加，說(shuō)明西格列汀對(duì)HUVECs的PI3K∕AKT通路具有激活作用。在西格列汀干預(yù)的同時(shí)聯(lián)用PI3K的抑制劑LY294002后，西格列汀降低細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表達(dá)、增加Bcl-2表達(dá)的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，由此證實(shí)西格列汀對(duì)HUVECs中PI3K∕AKT通路的激活介導(dǎo)了其抑制凋亡的效應(yīng)。

綜上所述，西格列汀能夠抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且該作用與激活PI3K∕AKT通路有關(guān)，未來(lái)可設(shè)計(jì)臨床研究來(lái)觀察西格列汀對(duì)糖尿病病人動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用。