劉海英 楊進(jìn)國(guó) 曾文強(qiáng) 顧欣 朱輝

摘要? 目的：觀察銀杏葉提取物對(duì)七氟醚致認(rèn)知功能的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法：將45只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、七氟醚組及干預(yù)組，每組15只。其中空白組不做任何干預(yù)措施，七氟醚組吸入七氟醚;干預(yù)組同樣予吸入七氟醚后腹腔注射銀杏葉提取物，用水迷宮比較各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，HE染色觀察海馬病理結(jié)構(gòu)改變，免疫印跡法檢測(cè)海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax表達(dá)水平的變化。結(jié)果：七氟醚組及干預(yù)組大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期較空白組延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中干預(yù)組明顯較七氟醚組改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）?？瞻捉M大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，七氟醚組及干預(yù)組大鼠海馬組織均出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形縮小，其中干預(yù)組海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)較七氟醚組改善。經(jīng)過(guò)銀杏葉提取物干預(yù)后大鼠海馬組織PI3K、Akt磷酸化程度提高以及Bcl-2表達(dá)增加，抑制Bax的表達(dá)。結(jié)論：銀杏葉提取物可明顯提升七氟醚所致認(rèn)知能力，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 七氟醚;大鼠;認(rèn)知;學(xué)習(xí)記憶能力;銀杏葉提取物注射液;海馬;機(jī)制;PI3K/Akt信號(hào)通路

Effects of Ginkgo Biloba Extract Injection on the Cognitive Function of Rats after Sevoflurane Anesthesia

LIU Haiying1，YANG Jinguo1，ZENG Wenqiang1，GU Xin2，ZHU Hui1

（1 Department of Anesthesiology，National Medicine Dongfeng General Hospital，Shiyan 442000，China; 2 Department of Cardiothoracic Surgery，the People′s Hospital of Shiyan 442000，China）

Abstract Objective： To observe the effects of Ginkgo Biloba extract on cognitive function induced by sevoflurane and explore its possible mechanism. Methods： A total of 45 SD rats were randomly divided into a blank group （ n =15），a sevoflurane group （ n =15） and an intervention group （ n =15）.Among them，the blank group did not take any interventions，the sevoflurane group inhaled sevoflurane，and the intervention group also received intraperitoneal injection of Ginkgo Biloba extract after inhaling sevoflurane.The changes of learning and memory ability of rats in each group were compared by water maze，and the pathological changes of hippocampus were observed by HE staining，Western blotting was used to detect the expression levels of PI3K，Akt，p-Akt，Bcl-2 and Bax in hippocampus. Results： 1） The swimming trajectory and escape latency period of rats in the sevoflurane group and the intervention group were longer than those in the blank group （ P <0.05），and those in the intervention group were significantly better than those in the sevoflurane group （ P <0.05）.2） HE staining showed that the hippocampal structure of rats in the blank group was normal，and the hippocampal tissue of rats in the sevoflurane group and the intervention group showed obvious structural destruction，disordered arrangement of cells and obvious deformation and shrinkage of neurons.The morphological structure of the hippocampus in the intervention group was better than that in the sevoflurane group.3） Western blotting showed that after the intervention of Ginkgo Biloba extract，the phosphorylation of PI3K and Akt and the expression of Bcl-2 in hippocampus were increased，and the concentration of Bax was inhibited. Conclusion： Ginkgo Biloba extract can significantly improve the cognitive function induced by sevoflurane，and its mechanism may be related to the inhibition of PI3K/Akt signal pathway.

Keywords? Sevoflurane; Rat; Cognition; Learning and memory ability; Ginkgo Biloba extract injection; Hippocampus; Mechanism; PI3K/Akt signal pathway

中圖分類號(hào)：R283 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.009

七氟醚以血?dú)夥峙湎禂?shù)低、麻醉誘導(dǎo)速度快、麻醉深度易于控制、蘇醒快速等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床，但隨著研究的不斷深入有文獻(xiàn)[1]揭示七氟醚可導(dǎo)致一過(guò)性認(rèn)知障礙，其作用機(jī)制與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，PI3K/AKT信號(hào)通路是經(jīng)典的抗凋亡通路，故我們認(rèn)為激活PI3K/AKT信號(hào)通路是改善術(shù)后認(rèn)知障礙的途徑。銀杏葉提取物屬于中藥制劑，目前研究揭示其有利于腦損傷與記憶等功能的恢復(fù)，但作用機(jī)制尚不明了。銀杏葉提取物改善認(rèn)知是否通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行介導(dǎo)？由此我們進(jìn)行動(dòng)物模型研究，以期探討銀杏葉提取物改善七氟醚引起認(rèn)知障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取45只SPF級(jí)SD雄性大鼠，購(gòu)自湖北省動(dòng)物研究中心（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2016-0016），體質(zhì)量220～250 g，平均體質(zhì)量（230±10.5）g;鼠齡3～5個(gè)月，平均鼠齡（3.5±1.1）個(gè)月。

1.1.2 藥物

七氟醚（購(gòu)自山東魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：65170507）;銀杏葉提取物（北京雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20169283）

1.1.3 試劑與儀器

Morris水迷宮供應(yīng)商來(lái)自中國(guó)科學(xué)院藥物研究所;PI3K（貨號(hào)：173665）、Akt（貨號(hào)：4691s）、p-Akt（貨號(hào)：4060s）、Bax（貨號(hào)：5023T）、Bcl-2一抗抗體（貨號(hào)：15071s），以上均購(gòu)自美國(guó)CST公司;生物雙筒顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司，型號(hào)：BM-1000）;Vamos氣體檢測(cè)儀（寧波市高品科技有限公司，型號(hào)NGP40-M400）。銀杏葉提取物注射液（金納多，中豪國(guó)際有限公司，批號(hào)：100270178）5 mL/支。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將45只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，分別是空白組、七氟醚組及干預(yù)組，每組15只。3組大鼠在鼠齡、體質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。具有可比性。模型制備（麻醉）：將七氟醚組及干預(yù)組置于自制麻醉箱（大小70 cm×40 cm×20 cm）中，將麻醉機(jī)接入麻醉箱，隨后麻醉機(jī)釋放七氟醚，同時(shí)使用Vamos氣體檢測(cè)儀對(duì)麻醉箱內(nèi)七氟醚濃度進(jìn)行檢測(cè)，使其保持濃度2.0%，持續(xù)吸入30 min，隨后用1.5%七氟醚麻醉維持4 h。

1.2.2 干預(yù)方法

完成1.2.1步驟后將七氟醚組大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，干預(yù)組腹腔注射銀杏葉提取物，1次/d，0.4 mL/kg。連續(xù)干預(yù)14 d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 Morris水迷宮測(cè)試

將水迷宮設(shè)置為4個(gè)象限，分別是第一象限、第二象限、第三象限及第四象限。每個(gè)象限均設(shè)置特殊標(biāo)記以便于實(shí)驗(yàn)鼠記憶位置信息。本研究將平臺(tái)置于第一象限，并將水迷宮內(nèi)注入清水直至沒(méi)過(guò)平臺(tái)，并在計(jì)算機(jī)軟件中標(biāo)記平臺(tái)位置，隨后將大鼠分別從一、二、三、四個(gè)象限的順序放入水中，記錄大鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間，設(shè)置為逃避潛伏期，同時(shí)記錄大鼠尋找到平臺(tái)的總路程。造模前對(duì)所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練2 d，4次/d。

1.3.2 HE染色觀察海馬病理結(jié)構(gòu)改變

從各組中隨機(jī)抓取3只大鼠，充分麻醉后取出腦組織，冰上分離出海馬組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液，隨后后進(jìn)行脫水，浸蠟，包埋，將蠟塊制作成每片5 μm的組織薄片，再根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行HE染色，具體步驟如下：二甲苯20 min→100%乙醇10 min→95%乙醇，5 min→80%乙醇5 min→蒸餾水5 min→蘇木精染色15 min→流水沖洗15 s→返藍(lán)20 min→伊紅染色5 s→流水沖洗15 s→80%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ5 min→二甲苯5 min→中性樹膠封片。隨后將玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 免疫印跡法檢測(cè)海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、Bax表達(dá)水平的變化

從各組中隨機(jī)抓取3只大鼠，充分麻醉后取出腦組織，按照100 mg∶ 1 mL裂解液的比例加入相應(yīng)體積的蛋白裂解液，4 ℃下靜置5 min，隨后將各樣本置于5 000 r/min中，離心半徑15 cm，離心10 min，隨后吸取上清液，并用BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白定量測(cè)定，并計(jì)算上樣量。隨后將蛋白樣本置于100金屬浴鍋中加熱變性10 min，用事先配置好的電泳膠體進(jìn)行電泳120 min，并將目的蛋白充分轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別加入PI3K、Akt、p-Akt、Bax及β-actin一抗抗體，用TBST將脫脂奶粉配制成5%濃度，將轉(zhuǎn)印后目的蛋白的PVDF膜進(jìn)行封閉2 h，隨后用PBS沖洗，置于顯影儀器中，滴入ECL顯影液，反應(yīng)60 s后進(jìn)行條帶掃描，得出OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組數(shù)據(jù)同時(shí)符合正態(tài)分布和方差齊性則采用單因素方差分析，若其中一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用多組秩和檢驗(yàn)，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組游泳軌跡和逃避潛伏期變化

七氟醚組及干預(yù)組大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期較空白組延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中干預(yù)組明顯較七氟醚組改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見(jiàn)表1及圖1。

2.2 HE染色結(jié)果

HE染色提示空白組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，七氟醚組及干預(yù)組大鼠海馬組織均出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形縮小，其中干預(yù)組海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)較七氟醚組改善。見(jiàn)圖2。

2.3 各組海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2表 達(dá)比較

七氟醚麻醉后大鼠海馬組織PI3K、p-Akt、? Bcl-2水平下降，Bax表達(dá)增加，經(jīng)過(guò)銀杏葉提取物干預(yù)后大鼠海馬組織PI3K、Akt磷酸化程度提高以及Bcl-2表達(dá)增加，抑制Bax的濃度。見(jiàn)圖3及表2。

3 討論

術(shù)后認(rèn)知障礙（Postoperative Cognitive Dysfunction，POCD）指的是術(shù)前無(wú)認(rèn)知方面缺損，受諸多因 素（以麻醉為主）后出現(xiàn)一定程度認(rèn)知能力下降，包括計(jì)算力、記憶力、定向力、執(zhí)行力等[2-4]。POCD不但嚴(yán)重影響病情恢復(fù)，還增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。POCD影響因素眾多，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚麻醉后極易導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，且多數(shù)發(fā)生于術(shù)后1～3 d[5-7]。海馬是與認(rèn)知功能關(guān)系密切的大腦組織結(jié)構(gòu)，根據(jù)解剖學(xué)可知[8-10]，海馬是大腦記憶回路的重要組分，目前大量關(guān)于認(rèn)知的研究亦集中于海馬。在本研究中我們對(duì)七氟醚麻醉后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示接受七氟醚麻醉的大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期較空白組延長(zhǎng)，這提示在七氟醚麻醉后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力確受到明顯受損，且在HE染色中我們發(fā)現(xiàn)七氟醚麻醉后大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形縮小，這就說(shuō)明七氟醚對(duì)大鼠的海馬結(jié)構(gòu)亦產(chǎn)生了不利的影響。

隨著研究的不斷深入研究人員發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞的異常凋亡與POCD關(guān)系密切，其中PI3K/AKT信號(hào)通路是經(jīng)典的抗凋亡通路，目前已有文獻(xiàn)[11-12]證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路可能是介導(dǎo)POCD的發(fā)生發(fā)展。PI3K是該通路重要因子，受激活后可促使細(xì)胞膜上重要成分肌醇發(fā)生磷酸化[13-14]，進(jìn)一步促使PI3K的第二信使因子PIP3生成，隨后PIP3于Akt相結(jié)合后AKT由此出現(xiàn)核移位后致其構(gòu)象發(fā)生變化，在構(gòu)象變化后產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)而被激活產(chǎn)生p-Akt[15-16]。Bcl-2與Bax均與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，當(dāng)Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，反而Bax表達(dá)強(qiáng)于Bcl-2時(shí)體現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)七氟醚麻醉后大鼠海馬組織PI3K、p-Akt、Bcl-2水平下降，Bax表達(dá)增加，這提示七氟醚麻醉引發(fā)POCD確與PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞異常凋亡有關(guān)。這與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)結(jié)果一致。

銀杏葉的主要成分是銀杏黃酮苷及銀杏總內(nèi)酯，有研究顯示銀杏葉制劑可明顯改善機(jī)體血脂代謝、血液流變學(xué)，是目前迄今為止被認(rèn)為是改善認(rèn)知行之有效的藥物之一。在本研究中我們利用銀杏葉提取物作為干預(yù)手段，結(jié)果顯示銀杏葉提取物明顯縮短七氟醚麻醉麻醉大鼠的游泳軌跡和逃避潛伏期，且改善了大鼠的海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)，這提示銀杏葉提取物確對(duì)POCD有明顯的腦保護(hù)效應(yīng)，此外我們進(jìn)一步檢測(cè)了PI3K/AKT信號(hào)通路標(biāo)志性蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)銀杏葉提取物干預(yù)后大鼠海馬組織PI3K、Akt磷酸化程度提高以及Bcl-2表達(dá)增加，抑制Bax的表達(dá)，這提示銀杏葉提取物可抑制細(xì)胞異常凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)POCD的腦保護(hù)效應(yīng)。由此七氟醚可對(duì)大鼠造成一過(guò)性認(rèn)知障礙，銀杏葉提取物可明顯提升認(rèn)知能力，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 謝建芬.丙泊酚和七氟烷麻醉對(duì)老年患者術(shù)后認(rèn)知功能的影響[J].臨床合理用藥雜志，2015，8（23）：65-66.

[2]范紅娜，李思沁，刁玉剛，等.體外循環(huán)對(duì)大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙影響[J].臨床軍醫(yī)雜志，2019，47（1）：23-26.

[3]何敬熹，高進(jìn).影響術(shù)后認(rèn)知功能障礙的麻醉藥物的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2018，33（12）：3411-3414.

[4]周奇韜，蔣毅，陳婕嬙等.不同麻醉深度對(duì)小兒術(shù)后認(rèn)知功能障礙及炎癥細(xì)胞因子的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（35）：59-63.

[5]曹寅，黃自生，陳益君.七氟醚與丙泊酚對(duì)沙灘椅位手術(shù)患者腦區(qū)域氧飽和度及術(shù)后認(rèn)知功能的影響[J].浙江醫(yī)學(xué)，2018，40（20）：2253-2256.

[6]余高鋒，李會(huì)仁，金尚怡.PD-1/PD-L1通路在七氟醚致大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用[J].新醫(yī)學(xué)，2018，49（7）：507-510.

[7]鄧立平，費(fèi)壽軍，賓略鈴，等.七氟醚麻醉深度對(duì)老年腹腔鏡手術(shù)患者術(shù)后認(rèn)知功能的影響研究[J].北方藥學(xué)，2018，15（7）：43-44.

[8]羅思琴，方開(kāi)云，蔣向平，等.七氟醚不同麻醉時(shí)間對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2018，58（26）：9-13.

[9]丁雯，陸志俊，孫繼輝，等.七氟烷對(duì)發(fā)育期小鼠海馬低親和力神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子p75和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響[J].上海醫(yī)學(xué)，2018，41（5）：270-274.

[10] 李繁，黎仕煥，黃奕弟.不同濃度七氟醚麻醉對(duì)大鼠氧化應(yīng)激及Caspase-9表達(dá)的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（13）：22-28.

[11]陳夢(mèng)月，陳偉東，柳怡敏，等.紫草素通過(guò)PI3K/Akt通路抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠原代皮層神經(jīng)元凋亡[J].中國(guó)病理生理雜志，2019，35（1）：106-111.

[12]楊光磊，王國(guó)強(qiáng)，米佳，等.滌痰湯糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（5）：1163-1167.

[13]賴文芳，洪海棉，張小琴，等.紅景天苷通過(guò)激活PI3K/AKT/NRF2通路減輕MCAO大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（5）：1883-1886.

[14]李秀坤，黃英華.基于PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討電針足三里、曲池對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（3）：303-306.

[15]鐘芳芳，吳承龍，孫新芳，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血后細(xì)胞凋亡及survivin和caspase-3表達(dá)的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21（10）：1103-1107.

[16]姜守軍，錢百成，張振鐸，等.針刺結(jié)合尼莫地平對(duì)急性腦出血患者血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)功能及血清腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)的影響[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（5）：1290-1293，1297.

[17]Fang Z，Ning J，Xiong C，et al.Effects of Electroacupuncture at Head Points on the Function of Cerebral Motor Areas in Stroke Patients：A PET Study[J].Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：902413.

（2019-04-09收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃優(yōu)秀中青年人才項(xiàng)目（Q20122404）

作者簡(jiǎn)介：劉海英（1980.01—），女，研究生，主治醫(yī)師，研究方向：臨床麻醉疼痛診療，E-mail：chengyan198303@163.com

通信作者：楊進(jìn)國(guó)（1972.12—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：麻醉與器官功能保護(hù)，E-mail：yrxczy@126.com