家蠶微孢子蟲海藻糖酶3的表達(dá)、定位及功能

張軼嶺, 李俊昊, 寧嘉興, Bismark KYEI, 沈中元

(江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院, 江蘇鎮(zhèn)江 212018)

微孢子蟲(microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物(Becneletal., 2005; 劉吉平和曾玲, 2006)，寄主范圍非常廣泛，可感染從無脊椎動物到脊椎動物的幾乎所有動物類群(Mathis, 2000)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1 500種，歸屬187個屬的微孢子蟲(Vávra and Luke?, 2013)。家蠶微孢子蟲Nosemabombycis是Carl Naggli在1857年鑒定的第一種微孢子蟲(Becneletal., 2005)。家蠶微孢子蟲感染家蠶引起的蠶病在蠶業(yè)上稱為家蠶微粒子病(pebrine)，是對養(yǎng)蠶業(yè)最具威脅性的一種毀滅性的病害，常對蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Bhatetal., 2009)。

海藻糖為二糖類碳水化合物，廣泛存在于各種生物包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、無脊椎動物以及低等和高等植物中(Elbein, 1974; Wingler, 2002; Elbeinetal., 2003; Frisonetal., 2007)。海藻糖首先是被作為能量儲存分子提出的。在許多昆蟲中，海藻糖提供了一種易于移動的能量儲備，在飛行過程中被利用(Beckeretal., 1996)。另外，在真菌孢子中海藻糖作為能量儲備，孢子發(fā)芽時伴有海藻糖的水解(Rousseauetal., 1972; Theveleinetal., 1982)。在分枝桿菌和棒狀桿菌中，海藻糖作為許多細(xì)胞壁糖脂的結(jié)構(gòu)組成部分發(fā)揮作用。在結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis中，細(xì)胞壁“臍帶因子”6,6-二霉菌酸海藻糖(trehalose 6,6-dimycolate) 對藥物和多肽都具有不滲透性。通過在這些分子周圍形成類似玻璃的結(jié)構(gòu)，它們可以防止脫水和氧化造成的損傷(Elbeinetal., 2003; Tournuetal., 2013)。海藻糖酶(trehalase)是一種糖苷酶，可催化一分子海藻糖水解為兩分子葡萄糖。家蠶微孢子蟲具有完整的海藻糖代謝和糖酵解途徑。家蠶微孢子蟲海藻糖酶(Nosemabombycistrehalase, NbTre)基因包括4個拷貝，即NbTre1,NbTre2,NbTre3和NbTre4(李孝良等, 2016)。目前對于家蠶微孢子蟲海藻糖酶不同拷貝的功能仍不清楚。本研究對其中的NbTre3基因進(jìn)行克隆并表達(dá)，通過免疫熒光、qRT-PCR及RNAi技術(shù)對NbTre3的功能進(jìn)行了初步的分析，旨在為家蠶微孢子蟲發(fā)芽的分子機(jī)制及能量代謝研究提供理論依據(jù)，為家蠶微粒子病的防治提供線索。

1 材料與方法

1.1 生物材料及試劑

家蠶Bombyxmori品系p50和家蠶微孢子蟲由本實驗室培養(yǎng)繁殖并保存；原核表達(dá)菌及分子克隆感受態(tài)細(xì)胞菌株BL21購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR、限制性核酸內(nèi)切酶、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒為TaKaRa 公司產(chǎn)品；Percoll 試劑為GE Healthcare 公司產(chǎn)品；qRT-PCR所用試劑購自TaKaRa公司；其他試劑配制所需藥品均為分析純。

1.2 家蠶微孢子蟲的擴(kuò)增與純化

以108個孢子/mL的成熟家蠶微孢子蟲懸液浸漬新鮮桑葉(黨曉群等, 2014)，晾干后喂給4齡起蠶，8 h后換以新鮮桑葉。待家蠶出現(xiàn)明顯的微孢子蟲感染癥狀時，收集病蠶，解剖取其絲腺，加入磷酸緩沖液(1×PBS)研磨至勻漿，4層紗布過濾，濾液經(jīng)3 000 g離心5 min，棄上清，經(jīng)1×PBS漂洗3次后用1×PBS重懸，緩慢加入到非連續(xù)密度梯度(30%, 45%, 60%, 75%和90%)的Percoll溶液液面上，12 000 g離心40 min，收集底部沉淀，用PBS漂洗3次，即得純化的家蠶微孢子蟲。

1.3 家蠶微孢子蟲基因組 DNA的提取

向震蕩管中加入1 mL(109個孢子/mL)純化的微孢子蟲懸液和1 mL酸洗玻璃珠，利用震蕩式小型珠磨式組織研磨器進(jìn)行研磨，震蕩速度在4 800～5 500 r/min，共震蕩6次，每次持續(xù)震蕩時間為60 s，每次震蕩結(jié)束立刻將其放入冰中進(jìn)行冷卻。研磨結(jié)束后，冰上靜止5 min，待玻璃珠全部沉降至液面下時，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，按照說明書操作程序提取家蠶微孢子蟲的基因組。

1.4 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)SilkPathDB(https:∥silkpathdb.swu.edu.cn/)已登錄的NbTre3 (NBO-2g0093)的序列設(shè)計引物(正向引物: 5′-CGCGGATCCATTCCAGTGGATCT AAATGC-3′, 下劃線示BamHⅠ酶切位點；反向引物: 5′-CCCAAGCTTTTTGACCAGTACTTCTTTGC-3′, 下劃線示HindⅢ酶切位點)，并以1.3節(jié)提取的家蠶微孢子蟲基因組DNA為模板對NbTre3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μL)：基因組DNA模板1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0) 25 μL, ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性2 min; 98℃變性10 s, 59℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

鑒定正確的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒回收后，用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET28a(+)在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliTop 10感受態(tài)細(xì)胞，涂布含硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單克隆菌落并接種于含硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，通過PCR及BamHⅠ和HindⅢ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。并將陽性質(zhì)粒送至上生工生物工(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.5 重組蛋白NbTre3的純化

將1.4節(jié)測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-NbTre3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，同時設(shè)pET28a(+)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌作為陰性對照，涂布于含適量硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；選擇PCR鑒定陽性的菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至其OD600為 0.6～0.8時，加入IPTG(終濃度為0.6 mmol/L)，37℃搖床繼續(xù)培養(yǎng) 6 h，離心收集細(xì)菌，用1×PBS洗3次；向樣品中加入40～60 μL的蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot(兔抗 6×His tag 作為一抗)鑒定；鑒定正確的菌體，冰上超聲破碎(功率50 W，超聲6 s，間隔6 s，次數(shù)50次)，12 000 g 4℃離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，沉淀用少量的1×PBS重懸后加入40 mL 20 mmol/L Binding Buffer混勻，4℃孵育過夜，次日按照Ni柱蛋白純化說明書對重組NbTre3進(jìn)行純化，并通過SDS-PAGE對純化的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.6 NbTre3 多克隆抗體的制備

1.5節(jié)純化的重組蛋白NbTre3經(jīng)過不同尿素含量(6, 4, 2和0 mol/L)的透析液處理后，采用BCA法對其濃度進(jìn)行測定。然后委托金斯瑞生物科技有限公司利用獲得的NbTre3免疫新西蘭兔，進(jìn)行多克隆抗體的制備。通過ELISA及Western blot對制備的多克隆抗體的效價和特異性分別進(jìn)行評估。

1.7 NbTre3的免疫熒光定位

純化的家蠶微孢子蟲用4%的多聚甲醛固定15 min；PBST浸洗玻片后用Triton X-100室溫通透20 min，PBST浸洗玻片后在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；每張玻片滴加足夠量(1∶200稀釋)的重組NbTre3多克隆抗體，放入濕盒，4℃孵育過夜；PBST洗玻片，滴加1∶1 000 (v/v)稀釋好的Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光二抗(生工生物工程(上海)股份有限公司)，濕盒中室溫孵育1 h；PBST浸洗玻片，滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST洗去多余的DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 qRT-PCR檢測家蠶微孢子蟲感染后家蠶5齡起蠶中腸中NbTre3的表達(dá)水平

5齡起蠶喂以涂抹108個孢子/mL的家蠶微孢子蟲懸液的新鮮桑葉2 h，分別在感染(喂食微孢子蟲)2, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120和144 h剖取家蠶中腸組織；每時間點每6頭家蠶為一組，每組為一個重復(fù)，共設(shè)4個重復(fù)。 液氮研磨，加入TRIzol試劑，按照試劑盒說明書提取中腸組織總RNA，DNaseⅠ室溫消化15 min 去除基因組DNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，以家蠶微孢子蟲β-tubulin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測NbTre3基因的轉(zhuǎn)錄水平，引物如表1所示。反應(yīng)體系(20 μL): TB Green Premix Ex Taq II 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL, ROX Reference Dye 0.4 μL, cDNA 模板 2 μL, 滅菌水補(bǔ)至20 μL。每個樣品設(shè)置4個重復(fù)孔。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性 30 s; 95℃變性15 s, 60℃退火及延伸 31 s, 反應(yīng)共40個循環(huán)。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

1.9 NbTre3基因的RNAi實驗

根據(jù)NbTre3基因的序列設(shè)計了3條特異性的siRNA(siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3)，設(shè)綠色熒光蛋白基因gfpsiRNA作為陰性對照(NC)(表2)，委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行合成。5齡起蠶喂以涂有108個孢子/mL的家蠶微孢子蟲懸液的桑葉，感染6 h后皮下注射siRNA(1 μg/蠶)，分別在注射后24, 48和72 h剖取中腸組織，每個時間點取6頭家蠶，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以家蠶微孢子蟲β-tubulin為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測NbTre3基因的轉(zhuǎn)錄水平；同時以家蠶actin3為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR檢測家蠶微孢子蟲16S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平，引物序列見表2。反應(yīng)體系: TB Green Premix Ex Taq II 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL, ROX Reference Dye 0.4 μL, cDNA 模板 2 μL, 滅菌水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性 30 s; 95℃變性15 s, 60℃退火及延伸 31 s, 反應(yīng)共40個循環(huán)。獨(dú)立重復(fù)實驗3次,每個樣品重復(fù)測定4次。另外，在siRNA干擾NbTre3基因表達(dá)后120 h，每處理取10頭家蠶5齡起蠶，剖取中腸組織研磨后在顯微鏡下觀察微孢子蟲的數(shù)量。

表2 siRNA序列Table 2 Sequences of siRNA

1.10 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR 結(jié)果數(shù)據(jù)根據(jù)2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計算分析(Livak and Schmittgen, 2001)，并用IBM SPSS Statistics 20 軟件進(jìn)行比較均值單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 重組NbTre3蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

為了構(gòu)建NbTre3的重組原核表達(dá)載體，首先通過PCR對NbTre3基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1(A)所示，獲得了一條長約800 bp的特異性條帶，與理論長度804 bp相符。然后，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和雙酶切后連接pET28a(+)載體獲得重組質(zhì)粒，PCR及雙酶切鑒定均獲得一條大小為800 bp左右的特異性條帶(圖1: B, C)，經(jīng)DNA測序驗證，結(jié)果表明重組原核表達(dá)載體pET28a-NbTre3構(gòu)建成功。

圖1 原核表達(dá)載體pET28a-NbTre3的構(gòu)建Fig. 1 Identification of the prokaryotic expression vector pET28a-NbTre3A: 從家蠶微孢子蟲基因組中PCR擴(kuò)增 NbTre3基因NbTre3 gene amplified from Nosema bombycis genome by PCR; B: pET28a-NbTre3的PCR鑒定PCR identification of pET28a-NbTre3; C: pET28a-NbTre3的酶切鑒定Digestion identification of pET28a-NbTre3; 1: NbTre3的PCR產(chǎn)物PCR product of NbTre3; 2: pET28a-NbTre3的PCR產(chǎn)物PCR product of pET28a-NbTre3; 3: pET28a-NbTre3酶切結(jié)果Restriction digestion result of pET28a-NbTre3; M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker. 箭頭指示目的基因NbTre3。Arrows show the target gene NbTre3.

將上述重組載體pET28a-NbTre3轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集表達(dá)細(xì)菌，利用SDS-PAGE(圖2: A)及Western blot(圖2: B)檢測均發(fā)現(xiàn)一條特異性的蛋白條帶，其分子量大小約為34 kD，與NbTre3蛋白理論分子量大小接近，結(jié)果表明重組蛋白NbTre3得以成功表達(dá)。

圖2 重組蛋白NbTre3的SDS-PAGE(A) 及Western blot(B)鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant protein NbTre3 by using SDS-PAGE (A) and Western blot (B) 1, 3: 轉(zhuǎn)化pET28a(+)的菌液蛋白pET28a(+) transformed bacteria solution protein; 2, 4: 轉(zhuǎn)化pET28a-NbTre3的菌液蛋白pET28a-NbTre3 transformed bacteria solution protein; M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker. 箭頭指示目的蛋白rNbTre3。Arrows show the target protein rNbTre3.

2.2 重組蛋白 NbTre3多克隆抗體

SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖3所示，在用尿素含量分別為150 mmol/L和200 mmol/L的洗脫液進(jìn)行洗脫時，均可獲得較純的NbTre3蛋白；然后，進(jìn)行透析以除去尿素等成分，通過SDS-PAGE再次檢測蛋白的純度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍只有一條特異性蛋白條帶(圖4: A)。說明透析過程中沒有蛋白的降解和雜蛋白的摻入。以純化的重組蛋白NbTre3為抗原免疫新西蘭兔制備抗體，Western blot檢測結(jié)果如圖4(B)所示，發(fā)現(xiàn)一條分子量大小約為34 kD的特異性條帶，說明制備的多克隆抗體特異性較好，可用于后續(xù)實驗。

圖3 SDS-PAGE檢測純化的重組蛋白NbTre3Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein NbTre3 M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker; 1-7: 分別為binding buffer, binding buffer以及20, 50, 100, 150和200 mmol/L不同尿素含量的蛋白洗脫液Protein elute with binding buffer, binding buffer, and 20, 50, 100, 150 and 200 mmol/L urea, respectively. 箭頭指示目的蛋白。Arrows show the target protein.

圖4 透析除鹽后的重組蛋白NbTre3的SDS-PAGE 分析(A)及其多克隆抗體的Western blot鑒定(B)Fig. 4 Identification of the desalinated recombinant protein NbTre3 by SDS-PAGE (A) and its polyclonal antibody by Western blotting (B) M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker; 1: 透析除鹽后的重組蛋白NbTre3 Desalinated recombinant protein NbTre3; 2, 3: NbTre3多克隆抗體Polyclonal antibody of NbTre3; 4: 免疫前血清Pre-immuned serum; 5: PBS. 箭頭指示目的蛋白。Arrows show the target protein.

2.3 NbTre3在家蠶微孢子蟲成熟孢子中的亞細(xì)胞定位

利用制備的抗NbTre3的多克隆抗體為一抗，Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光二抗，通過間接免疫熒光對家蠶微孢子蟲成熟孢子中NbTre3的分布進(jìn)行了檢測。結(jié)果如圖5所示，NbTre3主要分布在孢原質(zhì)中。

圖5 間接免疫熒光檢測NbTre3在家蠶微孢子蟲成熟孢子中的定位Fig. 5 Localization of NbTre3 in mature spore of Nosema bombycis detected by indirect immunofluorescence assay Light: 明視野 Bright field; AF488: 顯示綠色熒光抗體標(biāo)記的目的蛋白分布 Showing the distribution of the target protein labeled with green fluorescent antibody; DAPI: 顯示被DAP熒光I染料標(biāo)記的核 Showing the nuclei labeled with DAPI fluorescent dye. 孢子經(jīng)固定和透化后和NbTre3多克隆抗體(anti-NbTre3 pAb)或免疫前血清(pre-immuned serum)進(jìn)行孵育，然后孢子被洗過后和AF488標(biāo)記羊抗兔二抗進(jìn)行孵育，最后核酸用DAPI進(jìn)行標(biāo)記。After fixation and permeabilization, the spores were incubated either with anti-NbTre3 pAb or pre-immuned serum. And then the spores were washed and incubated with secondary antibody AF488 labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody. Finally, the DAPI was used to label the nuclei of spores.

2.4 微孢子蟲感染后不同時間NbTre3在家蠶中腸細(xì)胞中的表達(dá)譜

為了探索NbTre3在微孢子蟲不同發(fā)育時期所發(fā)揮的作用，qRT-PCR檢測NbTre3在家蠶5齡起蠶被微孢子蟲后不同時間點中腸組織中的相對表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示，NbTre3 在感染6 h的相對表達(dá)量最高，其余時間均保持在較低的水平。

圖6 qRT-PCR檢測家蠶微孢子蟲感染后不同時間NbTre3在家蠶5齡起蠶中腸中的表達(dá)譜Fig. 6 Expression profiles of NbTre3 in the midgut of the 5th instar larvae of Bombyx mori at different time post infection of Nosema bombycis detected by qRT-PCR 柱上不同小寫字母分別代表不同感染時間點家蠶中腸中NbTre3基因表達(dá)量的差異顯著性(n=4)(P<0.05, ANOVA)。Different lowercase letters above bars represent the significant differences (n=4) in the NbTre3 gene expression level in the midgut of silkworm at different infection time points (P<0.05, ANOVA).

2.5 RNAi下調(diào)NbTre3基因的表達(dá)

與對照組(NC)相比，siRNA-2對NbTre3 基因表達(dá)的抑制效果最明顯(圖7: A)；然而，NbTre3表達(dá)被抑制的同時，家蠶微孢子蟲16S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平并沒有明顯的變化(圖7: B)，此外，在siRNA干擾NbTre3基因表達(dá)后120 h我們剖取中腸組織研磨后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組微孢子蟲的數(shù)量無明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)，表明干擾NbTre3基因的表達(dá)對于家蠶微孢子蟲的復(fù)制并沒有明顯的抑制作用。

圖7 RNAi后家蠶5齡起蠶中腸中NbTre3(A)及16S rRNA(B)轉(zhuǎn)錄水平Fig. 7 Transcription levels of NbTre3 (A) and 16S rRNA (B) in the midgut of the 5th instar larvae of Bombyx mori after RNA interference NC: gfp siRNA; siRNA-1-3: NbTre3 siRNAs. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Data in theFigure are mean±SE.

3 討論

微孢子蟲的生活史可分為3個階段，即感染期、裂殖增殖期和孢子形成期(Vávra, 1976)。感染期即孢子發(fā)芽期，家蠶食下被微孢子蟲污染的桑葉后，孢子在消化道內(nèi)被活化，孢內(nèi)滲透壓增大，大量水分子進(jìn)入細(xì)胞，隨后極質(zhì)體和后極泡吸水膨脹壓迫極絲快速外翻彈出刺入寄主細(xì)胞，同時孢原質(zhì)在極絲彈出前被吸入極絲內(nèi)，最后具有感染性的孢原質(zhì)通過中空的極絲注入寄主細(xì)胞(Wingler, 2002)，即完成孢子發(fā)芽過程。關(guān)于孢子發(fā)芽的分子機(jī)制有兩種假說，一種假設(shè)認(rèn)為孢子壁上存在特殊的跨膜水通道，水通道蛋白可以特異性地使水分子快速通過孢子壁，使孢內(nèi)壓力增大，引發(fā)孢子發(fā)芽(Frixioneetal., 1992, 1997; Ghoshetal., 2006)。另一種假設(shè)認(rèn)為，在微孢子蟲發(fā)芽過程中伴隨有孢內(nèi)海藻糖含量降低而葡萄糖含量升高的現(xiàn)象，孢內(nèi)海藻糖降解為葡萄糖是引起孢內(nèi)壓力增大的重要原因(Vandermeer and Gochnauer, 1971; Undeen,1990)。也有研究分析表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化是水流入的一個原因(Huangetal., 2018)。外界刺激因素改變孢壁通透性后，使孢內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上起骨架支撐作用的Ca2+與外界離子競爭結(jié)合位點并被置換下來，引起孢膜結(jié)構(gòu)改變，由于間隔膜被打破，海藻糖與海藻糖酶相互接觸，大量降解為葡萄糖，孢內(nèi)滲透壓升高，促使水分進(jìn)入孢內(nèi)。

本研究通過原核表達(dá)及蛋白純化，制備了抗rNbTre3的多克隆抗體，Western blot檢測結(jié)果正確(圖4: B)，在小于30 kD大小處有不太明顯的非特異性條帶出現(xiàn)，分析原因可能是由于抗原蛋白降解或斷裂造成的。間接免疫熒光結(jié)果顯示，在家蠶微孢子蟲成熟孢子中，NbTre3主要分布在孢原質(zhì)中(圖5)。NbTre3基因表達(dá)譜分析結(jié)果表明，NbTre3在家蠶微孢子蟲感染家蠶初期(6 h)相對表達(dá)水平最高(圖6)，推測NbTre3在家蠶微孢子蟲發(fā)芽過程中發(fā)揮重要的作用(Vandermeer and Gochnauer, 1971; Undeen, 1990)。利用RNAi技術(shù)對NbTre3的表達(dá)達(dá)到了顯著的抑制效果，但微孢子蟲16S rRNA的轉(zhuǎn)錄水平并沒有受到明顯的抑制(圖7)，進(jìn)一步表明NbTre3在家蠶微孢子蟲侵染初期的發(fā)芽過程中發(fā)揮重要作用。

孢原質(zhì)進(jìn)入寄主細(xì)胞后，以二分裂或多分裂的方式發(fā)育成裂殖體，裂殖體增殖到一定階段細(xì)胞膜變厚，形成母孢子，母孢子以二分裂的方式形成孢子母細(xì)胞，再由孢子母細(xì)胞發(fā)育成成熟孢子。微孢子蟲的感染以及快速增殖是依賴于ATP的能量密集型的過程。但這些能量來源于哪里，是怎么產(chǎn)生的，目前尚未完全明確。Huang等(2018)利用RNAi技術(shù)下調(diào)分泌型家蠶微孢子蟲己糖激酶(Nosemabombycishexokinase, NbHK)的表達(dá)，可以有效抑制家蠶微孢子蟲的增殖，表達(dá)譜分析結(jié)果顯示分泌型NbHK可能在家蠶微孢子蟲的增殖期發(fā)揮重要作用。本研究通過qRT-PCR對微孢子蟲感染不同時間的家蠶5齡起蠶中腸組織中NbTre3基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NbTre3僅在感染初期高表達(dá)(圖6)，在裂殖增殖期和孢子形成期相對表達(dá)量均不高，RNAi對16S rRNA的轉(zhuǎn)錄活性沒有顯著影響(圖7)，表明NbTre3主要與孢子發(fā)芽和侵染有關(guān)。對于其他3個拷貝的海藻糖酶NbTre1, NbTre2和NbTre4在家蠶微孢子蟲的發(fā)芽或增殖期的能量供應(yīng)是否發(fā)揮作用還有待于進(jìn)一步的研究。