郝廣萍，靳 夢，張姍姍，劉可春，宋善友

(1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 檢驗系，山西 汾陽 032200； 2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物研究所，濟南 250103； 3.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院 衛(wèi)生信息管理系，山西 汾陽 032200)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床癥狀主要為震顫、肌肉僵直、行為遲緩[1]，主要病理特征為大腦黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元進行性損傷后大量減少，α-突觸核蛋白聚集形成“路易小體”[2]。盡管目前PD發(fā)病機制仍不明確，但是越來越多的研究證實DA神經(jīng)元損傷與大腦內(nèi)大量活性氧和活性氮自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)[3]。也有報道指出PD的發(fā)生與PD相關(guān)基因(α-syn、parkin、pink1)的異常表達有關(guān)，α-syn過表達產(chǎn)生聚集的α-突觸核蛋白、parkin失活后過度積累的Parkin底物蛋白及pink1發(fā)生缺失使得線粒體功能障礙后產(chǎn)生的自由基均會損傷DA神經(jīng)元，誘發(fā)PD[4-5]。近年來PD的發(fā)生也被廣泛認(rèn)為與自噬功能紊亂有著密切關(guān)系，自噬功能缺陷會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的積累與沉淀，誘發(fā)PD[6]；激活自噬功能，可緩解PD相關(guān)癥狀[7-9]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)牡丹籽油含有豐富的生物活性營養(yǎng)物質(zhì)，其中不飽和脂肪酸占90%左右。體外模型和體內(nèi)實驗均證明牡丹籽油中的不飽和脂肪酸能夠有效清除自由基，具有較強抗氧化作用[10]。大量研究證實抗氧化劑或具有抗氧化活性的物質(zhì)能夠有效清除活性自由基，從而具有神經(jīng)保護作用，在PD模型中有良好的療效[11]。不飽和脂肪酸能夠通過激活Nrf2-ARE信號通路，在小鼠PD模型中緩解PD[12]。牡丹籽油可以抗氧化，具有神經(jīng)元保護作用，但其是否具有抗PD活性仍未知。目前治療PD的傳統(tǒng)藥物主要包括左旋多巴、多巴胺受體激動劑及單胺氧化酶B抑制劑等，長期服用均會出現(xiàn)不良反應(yīng)，如左旋多巴類對控制PD最有效，但長期用藥會引起患者出現(xiàn)胃腸道不適等不良反應(yīng)，且不能延緩病情發(fā)展[13]，多巴胺受體激動劑能有效改善DA效應(yīng)及DA受體興奮性，但會導(dǎo)致發(fā)作性睡眠等不良反應(yīng)[14]，單胺氧化酶B抑制劑能延緩PD病情，但對酶抑制作用選擇性不強、副作用大[15]。牡丹籽油屬于食品級植物油，毒副作用小，若具有抗PD活性，可為牡丹籽油的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

斑馬魚因個體小、繁殖快、產(chǎn)卵多、成本低、易于飼養(yǎng)且通體透明，無需解剖即可觀察組織器官的發(fā)育等諸多優(yōu)勢，已成為研究神經(jīng)退行性疾病的最佳模式生物[16]。Vmat、Fli1分別特異性表達于斑馬魚DA神經(jīng)元與腦血管中，因此轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1：GFP常用于分別評價DA神經(jīng)元、腦部血管的發(fā)育狀況[17-18]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽(MPTP)是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，已被廣泛用于PD模型的誘導(dǎo)[19]。

本研究將牡丹籽油制成水溶性的牡丹籽油微囊粉，選用斑馬魚帕金森病模型作為研究對象，受精后1 d的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP胚胎和野生型斑馬魚AB胚胎，分別用不同方式分組處理，分析不同處理組斑馬魚的DA神經(jīng)元與腦血管發(fā)育情況、行為學(xué)、PD相關(guān)基因表達，探究牡丹籽油微囊粉是否具有抗PD活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、 轉(zhuǎn)基因斑馬魚Fli1:GFP、 野生型斑馬魚AB品系，均由山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選平臺提供。

牡丹籽油，菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽(MPTP)、1-苯基-2-硫脲(PTU)、亞甲基藍，美國Sigma公司；RN2802RNA試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司；RR036A反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara公司；RR091A熒光定量PCR試劑盒，Takara公司。

斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng)，北京愛生科技公司；SZX-16型奧林巴斯體視熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Zebrabox斑馬魚行為分析儀，Viewpoint公司；實時熒光定量PCR儀，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；C1000 Touch 梯度PCR儀，Bio-Rad公司；超微量分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹籽油微囊粉的制備

酪蛋白、乳糖和葡萄糖按質(zhì)量比2∶1∶1混合均勻，加蒸餾水溶解至質(zhì)量濃度90 g/L，用NaOH溶液調(diào)pH至8.5，105℃反應(yīng)3 h，冰水浴中冷卻至室溫，終止反應(yīng)，即制得具有抗氧化活性的復(fù)合壁材。取45 g牡丹籽油，用45 mL無水乙醇充分溶解，制成芯材乳濁液，緩慢滴加到上述壁材水溶液中。壁芯材按質(zhì)量比2∶1混合，高速分散器18 000 r/min下分散1.5 min，于35 MPa下高壓均質(zhì)3次，然后噴霧干燥得牡丹籽油微囊粉。噴霧干燥條件為：入口溫度180℃，出口溫度100℃，氣體流速7.5 L/min，分流速度80%，進樣轉(zhuǎn)速36 r/min。根據(jù)文獻[20]所述方法，測得牡丹籽油微囊粉包埋率為95.97%。

1.2.2 斑馬魚培養(yǎng)及胚胎的準(zhǔn)備

成年雌雄斑馬魚分開培養(yǎng)于斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng)中，水溫26℃，照明14 h/黑暗10 h交替進行，每日定時喂人工顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲無節(jié)幼體(Artemianauplii)。選擇成熟斑馬魚按雌雄比例1∶1，于傍晚時放入產(chǎn)卵缸中，次日8∶30抽取隔板，2 h后收取受精卵，剔除死胚，養(yǎng)殖水反復(fù)沖洗3次，移入含2 mg/L亞甲基藍的養(yǎng)殖水中[21]，置于26℃培養(yǎng)箱中孵化。

1.2.3 實驗分組及處理

將受精后1 d的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP、Fli1:GFP胚胎和野生型斑馬魚AB胚胎于6孔板中，每孔20個胚胎，每孔加適量養(yǎng)殖水，分為正常對照組、50 μmoL/L MPTP處理組，不同質(zhì)量濃度(25、50、100 μg/mL)的牡丹籽油微囊粉與50 μmoL/L MPTP共處理組(將牡丹籽油微囊粉母液與MPTP母液同時加入斑馬魚養(yǎng)殖水中，二者分別達到最終工作濃度，共同孵育)，每孔終體積5 mL，另外每孔按0.03 mg/mL加入PTU以抑制黑色素生成。加藥后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天換藥。

1.2.4 多巴胺神經(jīng)元及腦血管的檢測

受精后3 d時DA神經(jīng)元基本發(fā)育完全[22]。因此，受精后3 d時，將不同實驗組的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Vmat:GFP和Fli1:GFP在奧林巴斯體視熒光顯微鏡下分別觀察DA神經(jīng)元與腦部血管發(fā)育情況。

1.2.5 行為學(xué)監(jiān)測

受精后5 d時，將不同實驗組野生型斑馬魚AB幼魚(n=8)轉(zhuǎn)移至48孔板，1條/孔，加1 mL養(yǎng)殖水。將48孔板放入Zebrabox斑馬魚行為分析儀暗箱中，使其適應(yīng)環(huán)境。適應(yīng)15 min后開始行為學(xué)檢測，檢測時間設(shè)置為20 min。運用Zeblab軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算運動總距離和平均速度。

1.2.6 熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測PD相關(guān)基因的表達

取受精后5 d不同實驗組的野生型斑馬魚AB幼魚(n=40)進行qRT-PCR。RNA的提取參照試劑盒說明書進行，利用超微量分光光度計測定RNA濃度，控制A260/A280在2.0～2.5之間；RNA反轉(zhuǎn)為cDNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行；Real-time PCR參照實時熒光定量PCR說明書進行。α-syn引物序列：上游5′-ATGGATGTTTTTATGAAGGGGC-3′，下游5′-ACGCTGTCTTTGGTCTTGCT-3′。parkin引物序列：上游5′- GCGAGTGTGTCTGAGCTGAA-3′，下游 5′-ATCACAGCCCTGAAGTGTGG -3′ 。pink1引物序列：上游5′-GGCAATGAAGATGATGTGGAAC-3′，下游5′-ATCACGTTGGGATGAGCACT -3′。Real-time PCR擴增結(jié)束后輸出對照組和待測組目的基因CT值及內(nèi)參基因rpl13a的CT值，以相對定量法用2-ΔΔCT計算各組基因的相對表達量，并與正常對照進行比較。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用單因素方差分析,使用Graphpad prism 軟件進行Dunnett-t檢驗，并以平均值表示，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡丹籽油微囊粉對斑馬魚Vmat：GFP DA神經(jīng)元的影響(見圖1)

注：Ctl為正常對照組，MPTP為50 μmol/L MPTP處理組，25、50、100 μg/mL分別為相應(yīng)質(zhì)量濃度的牡丹籽油微囊粉與50 μmol/L MPTP共處理組，下同。白色括號指示DA神經(jīng)元。

圖1 牡丹籽油微囊粉對斑馬魚Vmat:GFPDA神經(jīng)元的保護作用

由圖1可見：受精3 d后，正常對照組中斑馬魚DA神經(jīng)元熒光面積大，MPTP處理組熒光面積小，DA神經(jīng)元明顯缺失；與MPTP處理組相比，不同質(zhì)量濃度的牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組中DA神經(jīng)元缺失不同程度減少，且減少程度與牡丹籽油微囊粉有一定劑量關(guān)系。研究結(jié)果表明，牡丹籽油微囊粉對DA神經(jīng)元具有保護作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.2 牡丹籽油微囊粉對斑馬魚腦血管損傷的影響(見圖2)

由圖2可見，受精后3d時，正常對照組中斑馬魚腦血管清晰可見，MPTP處理組中斑馬魚腦血管嚴(yán)重損傷，數(shù)量顯著減少，牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組中斑馬魚腦血管數(shù)量隨著牡丹籽油微囊粉質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，其中100 μg/mL牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組拯救回的腦血管數(shù)量最多。研究結(jié)果表明，牡丹籽油微囊粉可以拯救由MPTP引起的腦血管損傷，并且在一定范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度越高拯救效果越顯著。

注：白色箭頭指示拯救回的腦血管。

圖2 牡丹籽油微囊粉對斑馬魚Fli1:GFP腦血管的影響

2.3 牡丹籽油微囊粉對斑馬魚帕金森病行為的影響(見圖3)

注：A.運動軌跡；B.運動總距離；C.運動平均速度；與正常對照組相比， *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001; 與MPTP處理組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；a.0～60；b.60～120；c.120～180；d.180～240；e.240～300；f.300～360；g.360～420；h.420～480；i.480～540；j.540～600；k.600～660；l.660～720；m.720～780；n.780～840；o.840～900；p.900～960；q.960～1 020；r.1 020～1 080；s.1 080～1 140；t.1 140～1 200。

由圖3可見，相比于正常對照組，MPTP處理組斑馬魚的運動能力下降，運動總距離明顯減少，平均速度變慢。與MPTP處理組比較，牡丹籽油微囊粉與MPTP共同處理組斑馬魚的運動能力恢復(fù)，運動總距離增加，平均速度變快，并且隨著牡丹籽油微囊粉質(zhì)量濃度的提高，各項行為指標(biāo)變化愈加顯著。研究結(jié)果表明，牡丹籽油微囊粉可以緩解MPTP造成的斑馬魚帕金森病行為，且具有一定劑量依賴性。

MPTP可以誘導(dǎo)斑馬魚PD模型，具體表現(xiàn)為斑馬魚活動減少，行為受到抑制[23]，此外還出現(xiàn)血管缺陷和血液循環(huán)減少的現(xiàn)象[24]。本研究采用斑馬魚為動物模型，MPTP處理后，斑馬魚出現(xiàn)了DA神經(jīng)元缺損嚴(yán)重，腦部血管大幅減少，運動能力下降等表現(xiàn)，與以前研究中MPTP對斑馬魚的作用一致，這些變化符合PD特征，表明MPTP有效誘導(dǎo)了斑馬魚PD模型。牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組結(jié)果顯示：隨著牡丹籽油微囊粉質(zhì)量濃度的增加，斑馬魚DA神經(jīng)元缺損逐漸減少、腦血管數(shù)量逐漸增加、運動能力明顯恢復(fù)、運動總距離增加、平均速度變快。各項檢測指標(biāo)均有不同幅度緩解，均趨向于正常對照組，表明牡丹籽油微囊粉具有抗PD活性。其中100 μg/mL牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組對PD的緩解作用最為顯著。

2.4 牡丹籽油微囊粉對PD相關(guān)基因表達的影響

近些年來PD發(fā)病機制研究取得了重大進展，研究結(jié)果證明α-syn表達上調(diào)，parkin、pink1表達下調(diào)均會誘發(fā)PD[4-5]。為了進一步研究牡丹籽油微囊粉抗PD活性的機制，采用qRT-PCR檢測不同實驗組PD相關(guān)基因α-syn、parkin、pink1表達水平，結(jié)果見圖4。由圖4可見，與正常對照組相比，MPTP處理組α-syn表達上調(diào)，parkin、pink1表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，進一步證實MPTP誘導(dǎo)PD模型成功。與MPTP處理組相比，100 μg/mL牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組α-syn表達水平顯著下降(見圖4A)，50 μg/mL和100 μg/mL牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組parkin表達水平明顯上升(見圖4B)，牡丹籽油微囊粉3個質(zhì)量濃度組pink1表達上調(diào)且均有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖4C)。結(jié)果表明，不同濃度的牡丹籽油微囊粉可以調(diào)節(jié)3種基因的異常表達，使α-syn異常高表達水平降低，parkin、pink1異常低表達水平回升，推測牡丹籽油微囊粉可能通過調(diào)節(jié)這3個關(guān)鍵基因的表達從而減少α-突觸核蛋白聚集、Parkin底物蛋白的積累和線粒體功能障礙所產(chǎn)生的活性自由基，進一步減輕對DA神經(jīng)元損傷，緩解PD。隨著牡丹籽油微囊粉質(zhì)量濃度的增加，效果愈加顯著。根據(jù)研究結(jié)果可推測牡丹籽油微囊粉對PD的緩解作用可能與調(diào)控PD相關(guān)基因的異常表達有關(guān)。

注：與正常對照組相比， *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與MPTP處理組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

pink1和parkin是參與線粒體自噬的兩個重要基因，pink1和parkin突變會導(dǎo)致線粒體自噬功能障礙，出現(xiàn)病理蛋白異常聚集，誘發(fā)PD[25]。有研究證實艾灸可以通過增強pink1和parkin基因表達，緩解PD[26]。目前，已有研究證實尼洛替尼、姜黃素、雷帕霉素等化合物能夠在PD模型中通過激活自噬緩解PD[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)MPTP處理組的斑馬魚，pink1和parkin表達顯著下調(diào)，推測MPTP抑制了線粒體自噬，導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)病理蛋白聚集，誘發(fā)致PD相關(guān)癥狀。相較MPTP處理組，牡丹籽油微囊粉與MPTP共處理組的pink1和parkin基因表達上調(diào)，推測牡丹籽油微囊粉能夠通過促進自噬相關(guān)基因表達，激活線粒體自噬，使病理蛋白聚集減少，PD癥狀得到緩解。故牡丹籽油微囊粉的抗PD活性可能是通過激活線粒體自噬來實現(xiàn)的，具體機制有待于進一步研究。

3 結(jié) 論

牡丹籽油微囊粉具有抗PD活性(包括有效減少多巴胺神經(jīng)元損傷、保護腦部血管、緩解PD行為、調(diào)控PD相關(guān)基因的異常表達)，且具有劑量依賴性，其作用機制可能與激活線粒體自噬相關(guān)。