王杰 韓夢豪 許琳玉 劉儀云 許家月 陳蘇丹
摘要:為解決款冬生長周期長的問題,以款冬幼嫩無病蟲害侵染的葉片為試材,采用組培快繁技術,對其進行離體培養(yǎng),包括誘導愈傷組織、葉片增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化移栽4個過程。結果表明:最適誘導愈傷組織培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+2mg/LNAA,最適芽增殖分化培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L zT,最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5mg/L NAA,最適移栽基質(zhì)為珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6。
關鍵詞:款冬;組織培養(yǎng);愈傷組織;馴化移栽
款冬(Tussilago farfara L)為菊科款冬屬多年生草本植物,別名冬花、九九花,頭狀花序,花期2~3月。款冬花為我國傳統(tǒng)中藥材,歷代《中國藥典》均有收載。其性溫、味辛、微苦、歸肺經(jīng),具有平喘、升壓、抗炎、抗腫等功效,臨床使用十分廣泛。近幾年,環(huán)境污染所帶來的一系列問題成為人們關注的熱點,尤其是霧霾天氣引發(fā)的健康問題更是令人焦慮。人體吸入空氣中的雜質(zhì)和有毒氣體,導致咳嗽、呼吸困難等呼吸道疾病,嚴重影響著人們的身體健康。研究表明,款冬能有效地緩解上述并發(fā)癥,有止咳、化痰、潤肺之功效。但目前款冬花野生資源遭受嚴重的破壞,且人工栽培周期長,種植面積少,導致市場供不應求。本試驗以款冬為試材,建立完整組培體系,以期為進一步的工廠化、規(guī)?;a(chǎn)育苗提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗地概況
試驗于2018年9月~2019年6月在河南省洛陽市河南科技大學(112°24E,34°35N,)進行。洛陽市位于暖溫帶地帶,屬大陸性氣候。洛陽市年平均溫度為11~24%,與款冬天然生長氣候環(huán)境大致相同。
1.2試驗材料
款冬采集于河南省三門峽市盧氏縣,并移栽至河南科技大學開元校區(qū)統(tǒng)一管理。
1.3方法
1.3.1葉片的消毒處理。試驗采用生長旺盛、無病蟲害侵染的幼嫩葉片。先用淡洗衣粉水浸泡5min,輕微攪拌,然后流水沖洗0.5h,除去殘余??疃~片表面覆蓋細小絨毛,滅菌較為困難,因此用棉簽輕輕擦拭表面可以使消毒劑達到良好效果。本試驗設置75%乙醇、0.1g/L HgCI2分別處理30s、300s。
1.3.2培養(yǎng)條件。選用MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中加入濃度為30g/L蔗糖,8g/L瓊脂,培養(yǎng)基pH值5.6~6.4。培養(yǎng)條件為:光照強度2500~3100Lx,光照時間12hid,培養(yǎng)溫度22±3℃。
1.3.3誘導愈傷組織。將處理好的葉片在超凈工作臺上切成約1cm2的小正方形,接種于附加不同激素濃度6-BA、NAA的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。每組接種30瓶,每瓶接種3小塊葉片,在22±3℃光培養(yǎng)40d,誘導期間觀察其生長情況。
以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA(0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L),NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)共9組處理,上述各處理培養(yǎng)基均添加適量30g/L蔗糖、7g/L瓊脂。培養(yǎng)基pH值5.6~6.4。
1.3.4芽的增殖培養(yǎng)。選取生長良好的愈傷組織進行芽的增殖分化,將其接入附加不同濃度6一BA、NAA、zT的培養(yǎng)基上。每組處理接種30瓶,每瓶接種1塊愈傷組織。在22±3℃、光周期12h/12h(光,暗)的條件下培養(yǎng)30d,培養(yǎng)期間觀察其芽的增殖情況。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L),NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L),ZT(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L)共8組處理,上述各處理培養(yǎng)基均添加適量30g/L蔗糖,7g/L瓊脂。培養(yǎng)基pH值5.6~6.4。1.3.5生根培養(yǎng)。選取健壯飽滿的芽進行生根培養(yǎng),以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度NAA(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L),每組處理均添加0.5%活性炭,30g/L蔗糖,7g/L瓊脂,pH值5.6~6.4,培養(yǎng)30d,期間觀察根的生長情況。
1.3.6馴化移栽。將根長勢健壯的組培苗移人室溫中,在1周之內(nèi)將其瓶蓋慢慢打開,再完全打開放置2~3d,取出苗洗凈根部培養(yǎng)基。在4%高錳酸鉀溶液中浸泡根部10s,移栽至珍珠巖:蛭石:泥炭土=1:1:1與珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6的2種不同基質(zhì)配比中,每組處理10瓶。保持溫度22±3℃,含水量(95±5)%,適當遮蔭與通風,計算成活率。
2結果與分析
2.1不同植物激素對誘導愈傷組織的影響
接種3周后觀察,葉片四周有明顯膨大卷曲現(xiàn)象,大部分葉片邊緣形成黃綠色的凸起物。1mg/L 6-BA濃度中長勢最好;濃度為1.5mg/L 6-BA培養(yǎng)基中出現(xiàn)少量“燒苗”現(xiàn)象。在第6周觀察時發(fā)現(xiàn),濃度為0.5mg/L6-BA愈傷組織較致密,但長勢弱,不具備芽的增殖分化能力;濃度為1.5mg/L 6-BA出現(xiàn)“燒苗”現(xiàn)象;濃度為1.0mg/L 6-BA培養(yǎng)基中誘導愈傷組織致密;濃度為1.0mg/L 6-BA,0.2mg/L NAA最為突出,愈傷組織呈現(xiàn)出顏色淡黃綠色,致密且強壯。經(jīng)分析表明,MS+I.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA是較為理想的誘導愈傷組織培養(yǎng)基,誘導率為90.2%,愈傷組織呈黃綠色,強壯且致密,有較強的芽增殖分化能力。試驗結果如表1所示。
2.2不同植物激素對芽的增殖分化的影響
將長勢良好的愈傷組織轉入芽的增殖分化培養(yǎng)基上,2周之后觀察并記錄其芽誘導率。如表2所示,試驗結果表明,不同濃度的6-BA和ZT分別和NAA配比,在一定的濃度范圍內(nèi),芽的誘導率均呈現(xiàn)先上升后下降。以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA的培養(yǎng)基,芽數(shù)量多且健壯,基部無或有少量愈傷組織,生長情況良好,誘導率最高達65.21%。
2.3不同植物激素對生根培養(yǎng)的影響
當芽長到3cm左右,移人生根培養(yǎng)基,20d后根長有明顯的伸長情況。在第4周時對試驗材料進行觀察記錄。如表3所示,濃度為0.1mg/L NAA時平均根長最短且根較弱;濃度為0.5mg/L NAA時平均根長最長且根較健壯,達3.2cm;濃度為1.0m~LNAA時試管苗平均根長達2.6cm,且大部分培養(yǎng)基中存在少量愈傷組織。以上結果表明,誘導試管苗生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5%活性炭,試管苗平均根長為3.2cm,根生長健壯,根部無或有少量愈傷組織。
2.4不同基質(zhì)配比對馴化移栽影響
當平均根長達到3.2cm時,對其進行馴化移栽,30天后觀察并記錄成活率。如表4所示,發(fā)現(xiàn)2種基質(zhì)都較為適合試管苗的移栽,但珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6的基質(zhì)成活率更高。
3結論與討論
在處理款冬葉片時,因其背部覆細小絨毛,會影響消毒劑的消毒效果,需用棉簽擦拭表面,還可將吐溫-80加入75%酒精進行處理。兩者相比,棉簽使用更方便,去除絨毛較徹底,效果更明顯。在款冬葉片誘導愈傷組織時期,得出適宜的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA,與王貴軍試驗結果相比較,其誘導愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+I.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。兩者結果有較小的差異,其原因可能為款冬的產(chǎn)地不同,生長環(huán)境不同,栽培種類不同。在此期間發(fā)現(xiàn),部分愈傷組織出現(xiàn)“褐化”現(xiàn)象,出現(xiàn)“褐化”的原因與品種、培養(yǎng)基、取材季節(jié)等都有一定關系,其嚴重程度與酚類化合物的代謝有關,酚類化合物含量越高,“褐化”現(xiàn)象越嚴重。植物激素NAA可以在一定程度上阻礙酚類化合物的合成,緩解“褐化”的程度。
在芽的增殖分化時期,本試驗采用2種不同培養(yǎng)基進行培養(yǎng),一種是以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度配比的NAA與6-BA,一種是以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度比例的NAA與ZT。試驗發(fā)現(xiàn),2種培養(yǎng)基在一定濃度范圍內(nèi)對芽的增殖分化都有一定的促進作用,但以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA生長效果最好,試驗結果與任繼文等的報道結果類似。
在生根培養(yǎng)中得出最適培養(yǎng)基為I/2MS+0.5mg/LNAA+0.5%活性炭,與王貴軍研究報道結果相同?;|(zhì)的種類及其配比是影響款冬組培苗馴化移栽生長的重要因子,泥炭土具有巨大的吸水與保水能力,珍珠巖穩(wěn)定性強,吸水性好,可以疏松土壤使根系透氣。蛭石透氣性好,溫度變化小,有利于穩(wěn)定根系的環(huán)境溫度。采用這3種基質(zhì)有利于款冬的生長。從此次試驗得出,馴化移栽最適基質(zhì)比例為珍珠巖:蛭石:泥炭土=3:1:6,成活率高達89.72%,這與韋如萍研究結果不同。出現(xiàn)差異的原因是不同科屬的植物生長習性不同,對需水量及需氧量不同,所以對不同基質(zhì)的需求量不同。
本試驗建立了完整的款冬組培體系,極大地縮短了其栽培周期,為工廠化育苗提供理論依據(jù),在一定程度上可緩解款冬野生資源緊張,滿足市場的巨大需求。
(收稿:2019-09-16)