李枳蒙，張 婷，李 典，黃 俊，賴怡帆，吳婷婷，李博文，劉雄倫，2，3*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2 作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙 410128；3 水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，長沙 410128)

水稻(Oryzasativa)是我國乃至世界最主要的糧食作物之一，地球一半以上人口以稻米為食。由子囊真菌Magnaporthegrisea引起的水稻稻瘟病嚴(yán)重危害水稻正常的生長發(fā)育，影響稻米產(chǎn)量和品質(zhì)，稻瘟病爆發(fā)年份可造成10%～30%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時甚至絕收[1，2]。目前，防治稻瘟病的主要途徑是化學(xué)防治和種植抗病水稻品種，但化學(xué)防治成本較高且不環(huán)保，培育和推廣抗瘟水稻新品種是降低稻瘟病危害的上策[3，4]。稻瘟病抗性屬典型的質(zhì)量—數(shù)量性狀，利用已克隆或精細(xì)定位的主效抗性基因，開發(fā)高效分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，能最大限度地提高稻瘟病抗性育種的效率[5，6]。Pi9是一個廣譜持久抗稻瘟病基因，來源于小粒野生稻(Oryzaminuta)，經(jīng)遠(yuǎn)緣雜交導(dǎo)入到秈稻品系75-1-127，被定位在水稻第6號染色體的Pi2/9位點且被成功克隆[7，8]。本研究以75-1-127為Pi9基因供體親本，以高感稻瘟病的優(yōu)質(zhì)常規(guī)晚稻品種湘晚秈11號為受體親本及輪回親本，利用Pi9基因特異高效分子標(biāo)記，開展標(biāo)記輔助選擇育種實踐，改良湘晚秈11號的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料：Pi9基因供體親本75-1-127；受體及輪回親本湘晚秈11號；感病對照品系及稻瘟病誘發(fā)品種CO39。

稻瘟菌菌株：來自國內(nèi)外不同稻區(qū)的24份稻瘟菌菌株，用于室內(nèi)人工接種。

1.2 稻瘟病抗性表型鑒定及抗菌譜分析

室內(nèi)接種抗性鑒定和抗菌譜分析：將水稻材料75-1-127、湘晚秈11號、CO39播種于育秧基質(zhì)，26～28 ℃生長至4葉期，用0.2‰的 Tween 20水溶液將稻瘟菌菌株分生孢子配成濃度約1×105個/mL的懸浮液，活體噴霧接種；接種后用黑布覆蓋，于26 ℃、相對濕度>90%條件下培養(yǎng)24 h后，繼續(xù)在同溫濕度、12 h光照下誘導(dǎo)發(fā)病5～7 d；當(dāng)CO39葉片出現(xiàn)明顯病斑時觀察統(tǒng)計各材料抗性表型，參照文獻(xiàn)[9]中苗瘟調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)，將0～2級劃分為抗病類型，3～5級劃分為感病類型，并計算各供試材料對不同菌株的抗性頻率(抗性頻率=接種后不致病菌株數(shù)÷接種總菌株數(shù)×100%)。

田間病圃抗性鑒定：5月中旬將供試水稻材料和誘發(fā)品種CO39浸種催芽后播于湖南瀏陽大圍山自然病圃。6月中旬鑒定苗瘟抗性表型，9月中旬鑒定穗瘟抗性表型。

1.3 高效分子標(biāo)記鑒定與基因型分析

利用課題組已開發(fā)的Pi9基因內(nèi)的功能標(biāo)記Ins2-1(引物序列為Forward：5′-AACTGTTTTAAACACTCGGGTGGATA-3′；Reverse：5′-CACGATGATAACTTGGGCTAGGGCG-3′)[10]，分析75-1-127與湘晚秈11號之間的多態(tài)性，并將其用于標(biāo)記輔助選擇育種實踐中基因型的鑒定。抽穗前取水稻葉片約0.2 g于2.0 mL 滅菌離心管中，加入液氮研磨成粉末狀，采用CATB法[11]提取總DNA；利用標(biāo)記引物對各樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析標(biāo)記基因型。10 μL PCR反應(yīng)體系組成：DNA模板1.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min；16 ℃保存。

1.4 回交自交育種群體構(gòu)建

用湘晚秈11號作母本，75-1-127作父本，雜交獲得F1代；用湘晚秈11號作輪回親本，在長沙和三亞兩地連續(xù)回交直至獲得BC6F1代，自交兩代獲得BC6F3群體?；亟蝗后w構(gòu)建具體方法：自BC1F1代起，每世代田間種植約60株，取單株葉片做標(biāo)記基因型分析，選農(nóng)藝性狀與受體親本接近的陽性單株回交，混合收種，獲得下一世代。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試水稻材料的稻瘟病抗性表現(xiàn)及抗菌譜

根據(jù)室內(nèi)接種結(jié)果(表1)，75-1-127除了對湘2007A-7、ROR1這2份菌株感病外，其余均為抗病，抗性頻率為91.7%；湘晚秈11號對24份稻瘟菌菌株中的7份表現(xiàn)為抗病，其余17份均為感病，抗性頻率為29.2%；感病對照CO39對所有菌株均表現(xiàn)感病，抗性頻率為0。由田間病圃抗性鑒定結(jié)果(圖1)可以看出：受體親本湘晚秈11號高感苗瘟和穗瘟；而75-1-127高抗苗瘟和穗瘟。湘晚秈11號抗菌譜窄、抗性水平低，其稻瘟病抗性急需改良；75-1-127抗菌譜廣、抗性水平高，Pi9基因具有很好的育種價值。

表1 供試材料對24份稻瘟菌菌株的抗譜比較

圖1 供試水稻材料田間病圃稻瘟病抗性表型

2.2 分子標(biāo)記Ins2-1在雙親間多態(tài)性分析

雙親間多態(tài)性分析結(jié)果表明，Ins2-1是一個顯性DNA標(biāo)記，利用該標(biāo)記引物可從75-1-127基因組中擴(kuò)增出1條532 bp的清晰條帶，而在湘晚秈11號基因組中無擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2A)。并且該標(biāo)記PCR產(chǎn)物可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，操作簡單快速且成本較低。

2.3 湘晚秈11號改良抗病株系的選育

利用Ins2-1標(biāo)記，從湘晚秈11號×75-1-127的BC1F1代起，開展分子標(biāo)記輔助選擇育種實踐，于2016年獲得BC6F1群體，2018年篩選出11個BC6F3株系，2019年經(jīng)標(biāo)記基因型分析和田間病圃稻瘟病抗性鑒定，遴選出9個高抗稻瘟病的改良株系湘晚秈11號-Pi9(圖2)，為進(jìn)一步培育優(yōu)異抗病優(yōu)質(zhì)水稻新品種奠定了基礎(chǔ)。

圖2 抗病改良株系湘晚秈11 號-Pi9的鑒定

3 討論

水稻稻瘟病抗性屬于典型的質(zhì)量—數(shù)量性狀，抗性表型既受遺傳(基因)控制，又受病原菌、溫度、濕度、光照等環(huán)境因素影響，因此傳統(tǒng)育種的表型選擇往往不準(zhǔn)確、效率低。分子標(biāo)記輔助選擇育種是對標(biāo)記基因型的鑒定和選擇，不受環(huán)境因素影響，相對于傳統(tǒng)育種更準(zhǔn)確高效，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于作物遺傳改良，尤其是稻瘟病抗性育種。本研究鑒定出的顯性標(biāo)記Ins2-1，可以在供體親本75-1-127與受體親本湘晚秈11號間產(chǎn)生明顯而穩(wěn)定的多態(tài)性，選擇效率高，其擴(kuò)增產(chǎn)物可用瓊脂糖凝膠電泳檢測，成本低、效率高，具有較好的應(yīng)用前景。廣譜持久抗稻瘟病基因Pi9被成功克隆后，已被廣泛應(yīng)用于水稻育種實踐。如廖花等[12]利用Pi9基因序列開發(fā)出共顯性標(biāo)記SPL-1，通過分子標(biāo)記輔助選擇，將Pi9基因?qū)攵i稻恢復(fù)系R747 中，培育出了與受體親本遺傳背景高度相似的高抗稻瘟病新品系R747-Pi9，雜交種的稻瘟病抗性也同時改良；李永聰?shù)萚13]通過顯性標(biāo)記Ins1-1的輔助選擇，成功改良了秈稻恢復(fù)系R389及其雜交種的稻瘟病抗性；鄒俊鋒等[14]利用共顯性標(biāo)記Ins2-3改良了秈稻恢復(fù)系E32及其雜交種的稻瘟病抗性；殷得所等[15]通過Pi9基因緊密連鎖的共顯性STS標(biāo)記的輔助選擇育種，成功改良了揚稻6號、R6547及其雜交種的稻瘟病抗性。

本研究獲得的9個含Pi9基因的湘晚秈11號改良抗病系，將用于進(jìn)一步的農(nóng)藝、產(chǎn)量、米質(zhì)等性狀分析，以及不同生態(tài)區(qū)稻瘟病抗性鑒定，可望最終培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗瘟水稻新品種。