林愛華 苗莉云 王俊玲 李惠 宋發(fā)軍 張鵬

摘要：為獲得北蟲草（Cordyceps miditaris）CNZ蟲草酸最適的提取方法，比較了6種蟲草酸提取方法，結果表明超聲輔助醇提法蟲草酸的得率最高，達113.31mg/g，可作為初始提取方法。進一步通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取次數、固液比、超聲時間、乙醇濃度等條件，獲得北蟲草CNZ蟲草酸提取條件為：乙醉濃度20%體積分數），固液比1：10（g：mL），超聲時間20min，提取次數3次;在優(yōu)化的提取條件下，北蟲草CNZ蟲草酸得率為161.06mg/g，與初始提取條件相比提高了42.1%。

關鍵詞：北蟲草（Cordyceps militaris）;蟲草酸;提取方法;優(yōu)化

中圖分類號：S567.3⁺9 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0141-04

DOI：10.14088/j.cnki：issn0439-8114.2020.09：030

北蟲草（Cordyceps militaris）又稱蛹蟲草，屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌科（Clavicipitaceue）蟲草屬（Cordyceps）[1]，經液體發(fā)酵得到的北蟲草菌絲體的化學成分、藥理作用與天然冬蟲夏草非常相似，兩者屬于同屬異種真菌[2]。蟲草酸是蟲草類真菌的主要有效成分之一，又名D-甘露醇，具有利尿、抗氧化、預防與治療腦血栓等功效，其含量是蟲草產品的質量評價指標之一[3]。

冬蟲夏草是中國傳統(tǒng)的滋補性中藥材，然而野生蟲草資源日益匱乏，市場需求卻與日俱增[4，5]。利用北蟲草發(fā)酵生產蟲草酸等活性成分已成為替代野生蟲草獲得相關藥物的主要途徑[6，7]，而高效的蟲草酸提取方法是其關鍵技術之一。當前常用的蟲草酸提取方法有水提法[8]、醇提法[9]、微波提取法[7，10]、超聲輔提法[11]、熱水浸提法[12]、超聲-熱水浸提協(xié)同法[13]等。北蟲草菌CNZ是藥用植物內生菌資源開發(fā)與應用團隊新分離的一株蟲草菌。本研究分別采用乙醇和去離子水2種提取劑，選用熱浸法、超聲輔提法、超聲一熱浸協(xié)同法3種提取技術，共組合了6種蟲草酸提取方法，分別提取北蟲草CNZ的蟲草酸，篩選適用該菌株的初始蟲草酸提取方法，并進一步通過優(yōu)化提取次數、固液比、超聲時間、乙醇濃度等條件，建立適合北蟲草菌CNZ的蟲草酸提取方法，為其大規(guī)模發(fā)酵應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

北蟲草CNZ采自山西省晉中市烏金山國家森林公園，并參照文獻[14]報道的孢子分離法進行單克隆菌株的分離和純化。蟲草酸標準品和鼠李糖購自上海源葉生物科技有限公司。乙醇、乙酸銨、乙酞丙酮、冰醋酸、高碘酸鈉等分析純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。Nash試劑、0.015mol/L高碘酸鈉溶液、0.1%L-鼠李糖溶液的配制參照文獻[11]。

1.2 北蟲草CNZ的培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻[15]，固體培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2.0%的瓊脂。將北蟲草CNZ接種于固體培養(yǎng)基，27℃、避光培養(yǎng)一周后，光照培養(yǎng)2～3d至菌絲轉色。采用直徑6mm的打孔器截取轉色后的菌塊，按3菌塊/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基接種，27℃、175r/min培養(yǎng)12d。3層紗布過濾收集菌體，并于50℃烘干后研磨成粉，用于蟲草酸的提取。

1.3 蟲草酸含量的檢測

1.3.1 蟲草酸標準曲線的制作分別配制30、40、50、60、70、80、90mg/L的蟲草酸標準品溶液，參照文獻[16]和[17]報道的蟲草酸檢測方法，于412nm處測定各標準溶液的吸光值，并以質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制蟲草酸標準曲線。

1.3.2 蟲草酸含量的檢測及計算 參照文獻[16]和[17]報道的蟲草酸檢測方法，檢測1mL樣品的吸光值，代入蟲草酸標準曲線方程求得其蟲草酸濃度，并利用公式：蟲草酸得率（mg/g）=蟲草酸濃度（mg/L）×稀釋倍數×體積（mL）×10^-3/菌粉質量（g），計算其蟲草酸得率。

1.4 蟲草酸提取方法的篩選

分別采用乙醇和去離子水2種提取劑，參照文獻[18]選用熱浸法、超聲輔提法，并增加了超聲-熱浸協(xié)同法，共組合了6種蟲草酸提取方法。

1.4.1 超聲輔助水提法稱取0.5g菌粉，與5mL去離子水充分混勻，超聲輔提30min，8000r/min離心10min后，吸取上清液。再用5mL去離子水懸浮沉淀，并重復上述操作2次。合并上清，去離子水定容到100mL，取其中1mL，再定容到10mL作為待測樣品。

1.4.2 超聲輔助醇提法 采用50%（V/V，下同）乙醇替代“1.4.1”的去離子水，其余操作同“1.4.1”。

1.4.3 熱浸水提法 采用90℃水浴60min代替“1.4.1”的超聲輔提30min，其余操作同“1.4.1”。

1.4.4 熱浸醇提法 采用50%乙醇代替“1.4.1”的去離子水，采用90℃水浴60min代替“1.4.1”的超聲輔提30min，其余操作同“1.4.1”。

1.4.5 超聲-熱浸水提法 操作同“1.4.1”，但在超聲輔提30min后，再90℃水浴60min。

1.4.6 超聲-熱浸醇提法 操作同“1.4.2”，但在超聲輔提30min后，再90℃水浴60min。

1.5 蟲草酸提取方法的優(yōu)化

1.5.1 單因素優(yōu)化試驗 采用單因素試驗分別考察不同提取次數（1、2、3次）、不同固液比（1：5、1：10、1：15、1：20、1：30，g：mL）、不同乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%）和不同超聲時間（5、8、10、15、20min）對北蟲草CNZ蟲草酸提取效率的影響。

1.5.2 正交優(yōu)化試驗 采用L₉（3⁴）正交試驗分析提取次數（1、2、3次）、乙醇濃度（10%、20%、30%）、固液比（1：10、1：20、1：30，g：mL）和超聲時間（10、15、20min）對北蟲草CNZ的蟲草酸提取效率的影響。

2 結果與分析

2.1 蟲草酸標準曲線

以蟲草酸濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制其標準曲線見圖1。由圖1可見，在30～90mg/L范圍內蟲草酸濃度與其吸光值有較好的線性關系，回歸方程為y=0.0089x+0.0206，R²=0.9934。

2.2 蟲草酸提取方法的篩選

采用6種提取方法分別提取北蟲草CNZ的蟲草酸（表1），各提取方法的蟲草酸得率為：超聲輔助醇提法>熱浸醇提法>超聲-熱浸醇提法>超聲-熱浸水提法>超聲輔助水提法>熱浸水提法。超聲輔助醇提法的蟲草酸得率最高，為113.31mg/g，是蟲草酸得率次高的熱浸醇提法的1.48倍，是蟲草酸得率最低的熱浸水提法的3.39倍。超聲輔助醇提法較其他5種方法在蟲草酸提取得率和時間效益上都有較大優(yōu)勢。因此，選擇超聲輔助醇提法為北蟲草CNZ的初始蟲草酸提取方法。

2.3 蟲草酸提取方法的優(yōu)化

2.3.1 單因素優(yōu)化試驗 采用單因素法分析不同的提取次數、固液比、乙醇濃度和超聲時間對北蟲草cNz蟲草酸提取得率的影響（圖2），結果表明，提取3次的蟲草酸得率最高，為117.32mg/g（圖2A），比提取2次（116.12mg/g）的蟲草酸得率高1.2mg/g;1：20固液比的蟲草酸得率為132.34mg/g，高于其他固液比的得率（圖2B）;20%乙醇的蟲草酸得率為130：88mg/g，高于其他濃度乙醇的得率（圖2C）;15min超聲時間的蟲草酸得率為159.56mg/g，高于其他超聲時間（圖2D）。

2.3.2 正交優(yōu)化試驗 進一步采用4因素3水平正交試驗分析提取次數、乙醇濃度、固液比和超聲時間對北蟲草CNZ蟲草酸提取效率的影響（表2），結果表明，最優(yōu)的提取條件組合是A₃B₂C₁D₃，即提取次數為3次，乙醇濃度為20%，固液比為1：10（g：mL），超聲時間為20min.該條件下，北蟲草CNZ的蟲草酸得率為161.06mg/g，與初始提取條件相比提高了42.1%。通過極差分析可知，4個因素對蟲草酸得率的影響程度為提取次數>超聲時間>乙醇濃度>固液比。

3 小結與討論

分別以乙醇和蒸餾水做提取劑，采用熱浸法、超聲輔提法和超聲-熱浸協(xié)同法3種提取技術，共組合了6種蟲草酸提取方法，分別提取北蟲草CNZ的蟲草酸，發(fā)現(xiàn)對于北蟲草CNZ，超聲輔提法比熱浸法以及超聲一熱浸協(xié)同法的蟲草酸得率高。而鐘艷梅等[13]報道，對其研究的蛹蟲草而言，超聲一熱浸協(xié)同法的蟲草酸提取效率要優(yōu)于超聲輔提法和熱浸法。不同蟲草菌的蟲草酸提取方法不一樣，可能反映了菌株之間的差異。因此，針對新分離的北蟲草CNZ，建立其特異的蟲草酸提取方法是必要的。本研究也發(fā)現(xiàn)對于北蟲草CNZ，乙醇提取劑比水提取劑的蟲草酸得率高。這與張萍等[9]和閆文娟等[11]的報道一致，原因可能是乙醇具有較好的穿透細胞壁的能力，有助于破壞細胞膜，增加蟲草酸的浸出[12]。因此，本研究選擇超聲輔助醇提法作為北蟲草CNZ的初始蟲草酸提取方法，并進一步通過優(yōu)化提取次數、固液比、超聲時間、乙醇濃度等條件，建立了較適宜的提取方法，相比初始提取條件，蟲草酸得率提高了42.1%。

閆文娟等[11]報道廣東蟲草發(fā)酵菌絲的蟲草酸含量為11.28%;林群英等[19]報道廣東蟲草的蟲草酸含量為15.1%，高于冬蟲夏草和蛹蟲草;蔡友華礫[20]報道巴西蟲草的蟲草酸含量為12.05%。本研究報道的北蟲草菌CNZ的蟲草酸含量約為16.11%（161.06mg/g），屬于蟲草酸產量較高的菌株，具有潛在的應用價值。而本研究建立的北蟲草CNZ的蟲草酸提取方法，可為該菌株的大規(guī)模發(fā)酵及生產研究提供參考。

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收稿日期：2019-08-22

基金項目：國家自然科學基金（31370118;31770134）;“武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室建設”基金項目（2018BFC360）;中南民族大學基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（CZT18005，18006，18007）。

作者簡介：林愛華（1977-），女，山東煙臺人，講師，博士，主要從事應用生物化學研究，（電話）027-67842689（電子信箱）lah1999@163.com;通信作者，張鵬（1977-），男，副教授，博士，主要從事藥用植物與藥用微生物研究，（電話）027-67842689（電子信箱）zhangpenghust@126.com。