馬鈴薯氣生莖腐病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定及藥劑安全性試驗(yàn)

畢采利，呂文霞，劉廣晶，郝向玲，胡 俊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古中加農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 四子王旗 011800）

我國(guó)種植馬鈴薯已有400 多年的歷史。目前，我國(guó)馬鈴薯總產(chǎn)量居世界第一，是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)。馬鈴薯具有耐干旱、耐瘠薄、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的特性，在我國(guó)貧困地區(qū)的脫貧致富中發(fā)揮著重要作用[1]。內(nèi)蒙古馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量在全國(guó)排名第二，常年播種面積約66.67 萬(wàn)hm2，年鮮薯產(chǎn)量約為1 000 萬(wàn)t，馬鈴薯是內(nèi)蒙古自治區(qū)的主導(dǎo)農(nóng)產(chǎn)品[2]。馬鈴薯氣生莖腐病是近年來(lái)內(nèi)蒙古、廣西、廣東等地新發(fā)生的一種細(xì)菌性病害，該病菌可侵染種薯、葉柄、莖和塊根。連續(xù)陰雨天后，馬鈴薯莖基部會(huì)出現(xiàn)褐色至黑褐色軟腐；當(dāng)病癥嚴(yán)重時(shí)，莖基部先折斷后撕裂，易導(dǎo)致植株死亡，一般田塊植株發(fā)病率為10%～20%，有的超過(guò)50%，甚至?xí)?dǎo)致馬鈴薯苗大規(guī)模死亡，嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)。該病害發(fā)病程度與馬鈴薯品種、環(huán)境溫度、空氣濕度、降雨量等因素息息相關(guān)。除了采用清潔田園，與非寄主作物輪作等措施預(yù)防和控制馬鈴薯細(xì)菌性病害，還要嚴(yán)禁從發(fā)病區(qū)調(diào)運(yùn)種薯種苗[3-4]。當(dāng)前，防治馬鈴薯細(xì)菌性病害最有效的方法是化學(xué)防治，在藥劑防治的報(bào)道中主要使用農(nóng)用硫酸鏈霉素這一抗生素防治細(xì)菌性病害[5-7]。但是，為了減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用醫(yī)用抗生素可能引起的安全風(fēng)險(xiǎn)，選擇安全有效的殺菌劑預(yù)防和控制馬鈴薯細(xì)菌性病害顯得至關(guān)重要。本研究使用濾紙片抑菌圈法對(duì)市場(chǎng)上通常用于預(yù)防與控制植物細(xì)菌性病害的殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)抑菌毒力測(cè)定試驗(yàn)，并進(jìn)行不同殺菌劑對(duì)馬鈴薯發(fā)芽安全性試驗(yàn)，闡明每種藥劑對(duì)馬鈴薯氣生莖腐病菌的敏感性，找出替代硫酸鏈霉素的殺菌劑，從而為藥劑盆栽試驗(yàn)和大田藥劑防治試驗(yàn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：選用已分離鑒定具有致病性的馬鈴薯氣生莖腐病菌株B-1（Pectobacterium carotovorum subsp.brasilensis）。供試藥劑為0.3%四霉素、80%乙蒜素、1.8%辛菌胺醋酸鹽。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單藥劑毒力測(cè)定 抑菌圈法[8-9]：首先將每種供試殺菌劑制備成母液，然后分別稀釋成5 個(gè)濃度梯度。將直徑為5 mm 濾紙片浸入準(zhǔn)備好的藥液，放置10 min，后用無(wú)菌鑷子將其取出并進(jìn)行干燥，備用。待融化的LB 培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時(shí)，將細(xì)菌懸浮液（108CFU/mL）倒入LB 培養(yǎng)基，快速且均勻地混合，然后倒入平板制成包含細(xì)菌懸浮液的平板。待平板培養(yǎng)基凝固后，將3 片浸泡好藥劑的濾紙片放入含菌平板。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h后，使用十字交叉法用直尺測(cè)量抑菌圈直徑，每種處理重復(fù)3 次。

通過(guò)Excel 軟件建立毒力回歸方程y=ax+b，將藥劑濃度對(duì)數(shù)值作為自變量，將抑制率幾率值作為因變量，以求出各藥劑對(duì)供試菌的抑制中濃度EC50值和相關(guān)系數(shù)R2[10-12]。

1.2.2 混配藥劑增效測(cè)定

1.2.2.1 定性篩選混配藥劑的增效作用 采用陳福良等[13]推薦的HorsfaLL 法篩選藥劑的最佳配比。從單藥劑篩選結(jié)果中選取抑制效果最好的藥劑進(jìn)行兩兩混配，根據(jù)將要混配的2種單劑的有效中濃度即EC50值為基礎(chǔ)，根據(jù)10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10 的體積比配制2種單藥劑的有效中濃度藥液，然后進(jìn)行藥劑混配毒力測(cè)定試驗(yàn)。如果毒性比率＜1 則表明2種混配藥劑具有拮抗作用；若毒性比率為1 則表明兩種混配藥劑具有相加作用；若毒性比率＞1 則表明2種混配藥劑具有增效作用。其計(jì)算公式為

1.2.2.2 定量篩選混配藥劑的增效作用 采用陳福良等[13]推薦的Wadley 法對(duì)藥劑進(jìn)行定量篩選。制備單藥劑有效濃度梯度分別為500、200、100、50 和25 μg/mL，從混配藥劑定性篩選中挑選出最佳混配比例，按照濃度梯度順序，根據(jù)混配藥劑增效作用的定性篩選試驗(yàn)選出有增效作用組合的體積比將2種單藥劑混合，得到有增效作用的混配藥劑濃度梯度，之后進(jìn)行混配藥劑的毒力測(cè)定。如果毒力比值＜0.5 則表明2種藥劑混配表現(xiàn)出拮抗作用；若毒力比值在0.5～1.5 則表明2種藥劑混配具有相加作用；若毒力比值超過(guò)1.5 則表明2種藥劑混配具有增效作用。其計(jì)算公式為

1.2.3 不同殺菌劑對(duì)馬鈴薯發(fā)芽安全性試驗(yàn) 選用直徑和高均為25 cm 的花盆，并用20 g 左右的馬鈴薯切塊作為種薯，分別用0.3%四霉素261.78 倍液、523.56 倍液和1 047.12 倍液，80%乙蒜素2 842 倍液、5 685 倍液和11 370 倍液，1.8%辛菌胺醋酸鹽13 倍液、26 倍液和52 倍液進(jìn)行薯塊拌種，每種藥劑倍液分別用20 粒種薯塊進(jìn)行拌種。盆栽所用土壤均進(jìn)行180 ℃高溫滅菌處理5 h，以不加藥劑拌種處理為對(duì)照（CK），每種處理2 次重復(fù)，每次重復(fù)10 粒，并在15 d 后取出種薯以觀察發(fā)芽情況，測(cè)量芽長(zhǎng)并計(jì)算發(fā)芽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單藥劑毒力測(cè)定

由表1 可知，80%乙蒜素、0.3%四霉素、1.8%辛菌胺醋酸鹽3種殺菌劑對(duì)馬鈴薯氣生莖腐病菌有抑制作用，EC50值依次是140.72、5.73 和696.92 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2由回歸方程可得分別為0.965 4、0.956 2和0.939 2。

表1 供試藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

2.2 混配藥劑增效測(cè)定

2.2.1 定性篩選混配藥劑的增效作用 從單藥劑毒力測(cè)定篩選結(jié)果中選擇抑菌效果最好的3種藥劑進(jìn)行兩兩混配，即乙蒜素和四霉素，辛菌胺醋酸鹽和四霉素，辛菌胺醋酸鹽和乙蒜素。由表2 可知，乙蒜素和四霉素的混配組合中毒性比率超過(guò)1，具有增效作用的體積比是3∶7、5∶5、6∶4、7∶3；由表3 可知，辛菌胺醋酸鹽和四霉素的混配組合中毒性比率超過(guò)1，具有增效作用的體積比是6∶4、7∶3、8∶2、9∶1；由表4可知，辛菌胺醋酸鹽和乙蒜素混配組合中毒性比率超過(guò)1，具有增效作用的體積比是2∶8、4∶6。

2.2.2 定量篩選混配藥劑的增效作用 由表5 可知，四霉素∶乙蒜素（7∶3）的抑制效果最好，EC50為0.000 4 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2為0.955 2；乙蒜素：辛菌胺醋酸鹽（6∶4） 的抑制效果較差，EC50為138.239 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2為0.991 5。測(cè)定結(jié)果還

表明，四霉素與乙蒜素體積比為5∶5、7∶3、3∶7、4∶6，四霉素與辛菌胺醋酸鹽體積比為3∶7、4∶6、1∶9，乙蒜素與辛菌胺醋酸鹽體積比為8∶2 時(shí)的毒力比值大于1.5，表明2種藥劑按以上體積比混配具有增效作用；而乙蒜素與辛菌胺醋酸鹽體積比為6∶4 時(shí)的毒力比值為0.17，表明2種藥劑按以上體積比混配具有拮抗作用；四霉素與辛菌胺醋酸鹽體積比為2∶8 時(shí)的毒力比值為0.86，表明2種藥劑按以上體積比混配具有相加作用。

表2 乙蒜素與四霉素不同配比對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 單位∶%

表3 辛菌胺醋酸鹽與四霉素不同配比對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 單位∶%

表4 辛菌胺醋酸鹽與乙蒜素不同配比對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 單位∶%

表5 混配藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

2.3 不同殺菌劑對(duì)馬鈴薯發(fā)芽安全性試驗(yàn)

由表6 可知，80%乙蒜素3 個(gè)濃度拌種出芽率40%～85%，1.8%辛菌胺醋酸鹽3 個(gè)濃度拌種出芽率40%～100%，0.3%四霉素3種濃度拌種發(fā)芽率分別為100%、100%和60%，而高濃度四霉素處理過(guò)的芽長(zhǎng)稍短于CK，結(jié)果說(shuō)明高濃度四霉素、高濃度辛菌胺醋酸鹽和高濃度乙蒜素殺菌劑對(duì)馬鈴薯發(fā)芽均有一定抑制作用。

表6 不同濃度殺菌劑對(duì)馬鈴薯發(fā)芽影響

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外防治細(xì)菌性病害的新型化學(xué)藥劑種類比較少，以銅制劑為主[14-15]，經(jīng)濾紙片抑菌圈法毒力測(cè)定，對(duì)馬鈴薯氣生莖腐病具有直接抑制作用的有四霉素、乙蒜素、辛菌胺醋酸鹽3種殺菌劑，辛菌胺醋酸鹽是一種廣譜性殺菌劑，對(duì)一些真菌、細(xì)菌及病毒病害有一定的防治效果[16-18]。本研究中0.3%四霉素、80%乙蒜素、1.8%辛菌胺醋酸鹽3種殺菌劑對(duì)馬鈴薯氣生莖腐病菌有抑制作用，EC50值依次為5.73、140.72、696.92 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9。對(duì)這3種藥劑分別進(jìn)行定性與定量混配藥劑增效測(cè)定，定性測(cè)定結(jié)果表明乙蒜素和四霉素混配體積比為3∶7、5∶5、6∶4、7∶3，辛菌胺醋酸鹽和四霉素混配體積比為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，辛菌胺醋酸鹽和乙蒜素混配體積比為2∶8、4∶6 時(shí)，毒性比率大于1，具有增效作用；定量測(cè)定結(jié)果表明，四霉素與乙蒜素混配體積比為7 ∶3 的抑制效果最好，EC50為0.000 4 μg/mL。在藥劑對(duì)馬鈴薯安全性測(cè)定中，0.3%四霉素3 個(gè)濃度拌種出芽率為100%和100%、60%，高濃度四霉素處理過(guò)的芽長(zhǎng)稍短于CK，80%乙蒜素3 個(gè)濃度拌種出芽率40%～85%，辛菌胺醋酸鹽3 個(gè)濃度拌種出芽率40%～100%，結(jié)果說(shuō)明高濃度四霉素、高濃度辛菌胺醋酸鹽和高濃度乙蒜素殺菌劑對(duì)發(fā)芽均有一定抑制作用。

因此，在生產(chǎn)中，首選本研究中3種殺菌劑進(jìn)行防治馬鈴薯氣生莖腐病害，建議在病害預(yù)防過(guò)程中盡可能根據(jù)藥劑使用手冊(cè)中指定的濃度使用該藥物，以達(dá)到有效預(yù)防和治療病害的目的。