鐘文，魏江存，陳朝，邱文愷，王成龍，陸梅元，韋麗富

1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評查驗(yàn)中心，廣西 南寧 530029

紅背絲綢別名風(fēng)葉藤(《廣西植物名錄》)、野葡萄(《廣西藥用植物名錄》)、毛葉白粉藤(《中華本草》)、左爬藤、葫蘆葉、左邊藤(《云南藥用植物名錄》)、安痛藤(《現(xiàn)代中藥材鑒別手冊》)、苦郎藤(《中國植物志》)[1]。紅背絲綢為葡萄科植物毛葉白粉藤Cissusassamica(Laws.)Craib的干燥藤莖及根，具有拔毒消腫、散瘀止痛的功能，有止咳、平喘、解毒的功效，可用于治療咳嗽、哮喘、毒蛇咬傷、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、癰瘡腫毒等，民間多用于治療跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、骨折及癰瘡腫毒。紅背絲綢是廣西民間用于治療毒蛇咬傷的一種常用中草藥，對毒蛇咬傷具有良好的治療效果[2-3]，含有黃酮類、酚酸類、皂苷、有機(jī)酸等成分[1，4-5]。相關(guān)研究表明[6-15]，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和降血脂等藥理作用。

本實(shí)驗(yàn)以紅背絲綢的總黃酮含量為測定指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察提取方法、提取體積、提取溶劑濃度、提取時(shí)間4個(gè)因素對紅背絲綢藥材總黃酮含量測定的影響，再采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳的提取工藝，為進(jìn)一步研究紅背絲綢藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。目前，國內(nèi)對紅背絲綢中總黃酮含量測定的相關(guān)報(bào)道較少，為保證其藥材質(zhì)量及臨床使用效果，本實(shí)驗(yàn)建立了紅背絲綢總黃酮的含量測定方法，為建立紅背絲綢藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。植物總黃酮是極具藥用價(jià)值的天然資源，定量測定紅背絲綢總黃酮的含量，并比較不同產(chǎn)地紅背絲綢藥材總黃酮成分的含量差異，以完善紅背絲綢藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 本實(shí)驗(yàn)將對13批不同產(chǎn)地的紅背絲綢藥材進(jìn)行總黃酮的含量測定，為制定紅背絲綢藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津UV1780型紫外-可見分光光度計(jì)；純水儀(法國，密理博)；十萬分之一天平(XS105D，梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司)；DFT-1000高速萬能打粉機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 試藥

蘆丁(批號(hào)：185126，純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)；其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

藥材信息見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳勇教授鑒定為紅背絲綢Cissusassamica(Laws.)Crail，經(jīng)60 ℃烘干，備用。

表1 紅背絲綢樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥恒重的6.24 mg蘆丁對照品，置25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，既得蘆丁對照品溶液(0.249 6 mg·mL-1)。

2.2 供試品溶液制備

取藥材粗粉1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液30 mL，水浴加熱回流提取1.0 h，再稱質(zhì)量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL置25 mL量瓶中，即得樣品溶液。

2.3 線性方程的制定

分別精密量取2.1項(xiàng)下對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在512 nm測定。以吸光度對濃度做線性方程：Y=8.715 7X-0.005 6，r=0.999 2，質(zhì)量濃度為0.012 48～0.099 84 mg·mL-1與吸光度有良好的線性關(guān)系。

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度試驗(yàn)

精密稱取廣西富川縣采集的紅背絲綢粗粉約1.0 g，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定。在波長512 nm處連續(xù)6次測定其吸光度，測定結(jié)果RSD為1.26%，故該方法精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取廣西富川縣采集的紅背絲綢粗粉約1.0 g，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定，測定同一供試液在不同時(shí)間下的吸光度，于512 nm波長處分別在0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度，RSD為2.64%，結(jié)果表明，吸收度值在120 min內(nèi)基本不變?？梢姌悠吩?20 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取廣西富川縣采集的紅背絲綢樣品6份，每份粗粉約1.0 g，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定。在波長512 nm處平行測定6份樣品的吸光度，計(jì)算紅背絲綢總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.46 mg·g-1，RSD為2.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取廣西富川縣采集的紅背絲綢粗粉6份，每份約0.5 g，精密加入蘆丁對照品17.2 mg，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定。在波長512 nm處平行測定樣品吸光度，計(jì)算藥材樣品總黃酮的含量。結(jié)果平均回收率為98.76%，RSD為2.63%(n=6)，表明該方法回收率良好，見表2。

表2 紅背絲綢總黃酮加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

4 單因素考察

4.1 黃酮最大吸收波長的確定

本次實(shí)驗(yàn)顯色后對樣品溶液和蘆丁對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，波長400～600 nm，見圖1。在400～600 nm有2個(gè)最大吸收波長，分別是510、512 nm。因?yàn)闃悠啡芤簽榛旌衔?，成分?fù)雜而且雜質(zhì)多，最大吸收波長較蘆丁略有偏差，所以測試波長選用512 nm。

注：1.對照品，最大波長為510 nm；2.樣品，最大波長為512 nm。圖1 蘆丁和樣品溶液的可見光吸收光譜掃描圖

4.2 提取方法考察

精密稱取廣西富川縣采集的藥材粗粉約1.0 g，置錐形瓶中，提取時(shí)間1.0 h、溶液體積30 mL、70%乙醇為提取條件，分別使用超聲提取法、回流提取法和浸漬法提取藥材總黃酮，按照2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按照2.3項(xiàng)下的方法顯色測定，結(jié)果表明，回流提取法的總黃酮提取效率最高，故而選擇回流提取。見圖2。

圖2 紅背絲綢總黃酮提取方法考察結(jié)果

4.3 乙醇溶劑濃度考察

取廣西富川縣產(chǎn)的藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，提取時(shí)間1 h、30 mL不同濃度的乙醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，以乙醇溶劑不同濃度對藥材總黃酮得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定，結(jié)果表明，70%乙醇回流提取藥材總黃酮的得率最高，見圖3。

圖3 紅背絲綢總黃酮提取乙醇濃度考察結(jié)果

4.4 提取時(shí)間考察

精密稱取廣西富川縣采集的藥材粗粉約1.0 g，置錐形瓶中，以30 mL的70%乙醇為提取條件，選擇回流提取法，以提取時(shí)間對藥材總黃酮得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定，結(jié)果顯示提取時(shí)間為2.0 h的提取率最高，見圖4。

圖4 紅背絲綢總黃酮提取時(shí)間考察結(jié)果

4.5 提取體積考察

取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，提取時(shí)間1 h、70%乙醇為提取條件，采用回流提取法，以70%乙醇不同體積對藥材總黃酮得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)70%乙醇提取體積為分別10、20、30、40、50、60 mL，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定，結(jié)果顯示提取體積為30 mL的提取率最高，見圖5。

圖5 紅背絲綢總黃酮提取體積考察結(jié)果

5 正交試驗(yàn)考察

5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從紅背絲綢中提取總黃酮的方法主要是使用有機(jī)溶劑提取。根據(jù)文獻(xiàn)資料，本實(shí)驗(yàn)最終使用不同乙醇濃度為溶劑的提取方法，根據(jù)單因素考察結(jié)果，設(shè)置乙醇濃度分別為60%、70%、80%；料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40；提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5 h這3個(gè)條件[16-17]。根據(jù)分析軟件，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表3。

表3 紅背絲綢總黃酮L9(34)正交因素水平

精密稱取紅背絲綢藥材粉末約1.0 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按2.3項(xiàng)下的方法顯色測定，再按L9(34)正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，使用紫外-可見分光光度計(jì)測定紅背絲綢總黃酮含量，見表4～5。

5.2 結(jié)果分析

5.2.1正交試驗(yàn)

表4 紅背絲綢總黃酮L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 紅背絲綢總黃酮提取正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

5.2.2結(jié)果分析 根據(jù)分析軟件，方差分析結(jié)果可知，以總黃酮的含量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，方差分析證明，乙醇濃度和提取體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而提取時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各影響因素的強(qiáng)弱為B>A>C，所以對紅背絲綢提取效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是乙醇濃度和提取體積，考慮效率和時(shí)間，故而選擇提取時(shí)間為1.0 h，因此最理想的提取方案是A2B2C1，即乙醇濃度是70%，料液比是1∶30，回流提取時(shí)間是1.5 h，此提取效果最佳。

6 樣品含量測定

精密稱取13個(gè)不同產(chǎn)地紅背絲綢粗粉3份，每份約1.0 g，置錐形瓶中，按照2.2項(xiàng)下操作步驟制備供試品，按照2.3項(xiàng)下的方法顯色測定其總黃酮的含量，每個(gè)產(chǎn)地測定3份藥材總黃酮取平均值。結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地紅背絲綢藥材總黃酮含量測定結(jié)果 mg·g-1

7 討論與總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以紅背絲綢為研究對象，考察乙醇濃度、提取體積和提取時(shí)間等影響因素，利用正交試驗(yàn)的方法來優(yōu)選紅背絲綢總黃酮的最佳提取工藝。根據(jù)影響因素的選擇，采用L9(34)正交試驗(yàn)，進(jìn)行多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，紅背絲綢藥材總黃酮的最佳提取工藝：回流提取，乙醇濃度為70%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為1.5 h，此提取效果最佳，該試驗(yàn)得到的最佳工藝提取條件數(shù)據(jù)可靠。除此之外，還可以考察提取溫度、提取溶劑、溶劑pH和提取次數(shù)等。

不同產(chǎn)地紅背絲綢藥材中總黃酮含量差異較大，廣西靖西市的紅背絲綢總黃酮含量最高，其次是云南富寧縣和廣西富川縣、廣西鐘山縣、廣西賀州市和廣西梧州市，而廣西合浦縣和貴州興義市產(chǎn)的紅背絲綢藥材總黃酮含量最低。不同產(chǎn)地紅背絲綢總黃酮的含量差異可能是由于不同地域、不同氣候、不同土壤以及不同的采摘季節(jié)影響而產(chǎn)生的結(jié)果。

紅背絲綢自然資源豐富，在臨床中廣泛使用。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對紅背絲綢總黃酮的研究還較少，為保障其臨床用藥合理、安全、有效，本研究通過正交試驗(yàn)篩選出紅背絲綢總黃酮的最佳提取工藝，為進(jìn)一步研究、開發(fā)紅背絲綢的藥用資源提供參考。