張小利，賀 蓓，路發(fā)凱

（1.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海201401；2.上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，上海201203）

0 引言

痰熱清注射液是一種由中藥“有效部位群”研制而成的新制劑，方中以黃芩為君藥，熊膽粉、山羊角為臣藥，金銀花為佐藥，連翹為使藥［1］。該藥于2003 年5月通過國家藥品監(jiān)督管理局批準上市，臨床上多用于治療呼吸系統疾病［2］。目前痰熱清注射液亦用于治療新型冠狀病毒性肺炎（COVID-19），同時中國臨床試驗注冊中心批準了《大劑量痰熱清注射液治療新型冠狀病毒性肺炎（COVID-19）真實世界臨床研究》（注冊號ChiCTR2000029432）和《痰熱清膠囊治療新型冠狀病毒性肺炎（COVID-19）臨床試驗》（注冊號ChiCTR2000029813）兩項臨床試驗，以評價痰熱清注射液治療COVID-19的有效性及安全性［3］。本研究按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局的《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》要求進行了血管刺激性、溶血及全身主動過敏反應（ASA）試驗，為臨床應用提供安全性再評價實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭白色家兔16 只，雌雄各半，體質量2.2～2.5 kg，購于上海市松江區(qū)車墩實驗動物良種場，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2007—0008。新西蘭白色家兔均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學普通級兔房［SYXK（滬）2009—0069］，環(huán)境溫度19～22 ℃，相對濕度60%～69%，換氣次數≥8 次/h。人工控制照明，晝夜交替時間為12 h/12 h。清潔級哈特蘭豚鼠28 只，雌雄各半，體質量207.9～264.1 g，購于上海生物制品研究所，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2009—0020。豚鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學清潔級豚鼠房［SYXK（滬）2009—0069］，環(huán)境溫度21～22 ℃，相對濕度46%～64%，換氣次數≥15 次/h。人工控制照明，晝夜交替時間為12 h/12 h。所有動物實驗嚴格遵守上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 藥品與主要試劑

痰熱清注射液，上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產（棕紅色澄明液體，規(guī)格：10 mL/支，含量：0.335 g/mL（生藥量/藥液），批號：1308317），臨用時用氯化鈉注射液稀釋成所需濃度的溶液；氯化鈉注射液，上海長征富民金山制藥有限公司生產（批號：121012 05C）；烏來糖，國藥集團化學試劑有限公司產品（批號：T20110214）。牛血清白蛋白，上海源葉生物科技有限公司提供（白色結晶或類白色冷凍干燥粉末，批號：LJ0718SA13）。上述藥品均密封，避光，置陰涼干燥處保存。

1.3 實驗儀器

TC6K 型電子天平；Leica TP1020 全能型脫水機；Tissue-Tek VIP-5 全封閉組織脫水機；Histo Star 石蠟包埋機；HMS 70全自動染色機；HM340E型輪轉式組織切片機；OLYMPUS BH-2光學顯微鏡、BX51型系統顯微鏡；DK-8A型恒溫水槽；Agilent 8453型紫外分光光度計。

2 方法

2.1 血管刺激性實驗

實驗開始前，家兔經7 d 檢疫，2 d 適應性飼養(yǎng)。家兔按體質量分層隨機進行分3 組，每組4 只，雌雄各半，即痰熱清注射液低劑量（1∶20稀釋，濃度4.76%，給藥容量3.51 mL/kg，相當于0.167 mL/kg痰熱清注射液原液）、中劑量（1∶10 稀釋，濃度9.09%，給藥容量3.66 mL/kg，相當于0.333 mL/kg 痰熱清注射液原液）及高劑量（1∶5稀釋，濃度16.67，給藥容量4.00 mL/kg，相當于0.667 mL/kg 痰熱清注射液原液）。采用自身對照，每組4 只，雌雄各半。右側耳緣靜脈以無菌操作方法分別注射低、中及高劑量的痰熱清注射液，左側耳緣靜脈注射等體積氯化鈉注射液，每天1次（qd），連續(xù)給藥3 d。于末次給藥后72 h，肉眼觀察注射部位有無紅腫、充血等血管刺激癥狀，腹腔注射25%烏來糖麻醉處死動物，以耳緣靜脈注射點至向心方向，每隔1.5 cm 取一段，每段1 cm，連續(xù)取3 段耳緣靜脈連同周圍組織，10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切4 μm 薄片，HE 染色，光鏡下進行組織病理學檢查，另一側對照血管也同法處理。

2.2 溶血試驗

2.2.1 紅細胞混懸液制備

實驗開始前，家兔經7 d 檢疫，2 d 適應性飼養(yǎng)。家兔心臟取血約10 mL，置洗凈干燥的玻璃杯中，玻璃棒輕輕攪拌除去纖維蛋白，然后將去纖維蛋白血移入刻度離心管內加入10 倍生理鹽水，搖勻后離心15 min（1 000 pr/min），傾去上清液，再加入約10 倍生理鹽水混合離心，反復洗3次，至上清液呈無色透明，然后將所得紅細胞按其容積，用生理鹽水稀釋成2%的紅細胞混懸液80 mL備用。

2.2.2 加樣觀察

取潔凈試管7支進行編號，1～5號管為痰熱清注射液（1∶10稀釋，濃度9.09%，給藥容量3.66 mL/kg，相當于0.333 mL/kg 痰熱清注射液原液），6 號管為陰性對照管（氯化鈉注射液），7 號管為陽性對照管（滅菌純水），按表1 所示依次加樣，輕輕混勻后，立即置37 ℃±0.5 ℃的恒溫水浴箱中進行溫育，每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h。同法重復3次。

2.2.3 結果判斷

①全溶血：溶液澄明紅色，管底無細胞殘留。②部分溶血：溶液澄明紅色或棕色，管底有少量紅細胞殘留。③無溶血：紅細胞全部下沉，上層液體無色澄明。④凝聚：雖不溶血，但出現紅細胞凝聚，振搖后不能分散。

2.3 全身過敏試驗

2.3.1 致敏

實驗開始前，豚鼠經5 d 檢疫，1 d 適應性飼養(yǎng)。豚鼠按體質量分層隨機進行分4組，每組6 只，♀♂各半，即陰性對照（氯化鈉注射液，給藥容量4.00 mL/kg）組、痰熱清注射液低劑量（1∶10 稀釋，濃度9.09%，給藥容量3.66 mL/kg，相當于0.333 mL/kg痰熱清注射液原液）組、高劑量（1∶5 稀釋，濃度16.67%，給藥容量4.00 mL/kg，相當于0.667 mL/kg痰熱清注射液原液）組和陽性對照（2.5%牛血清白蛋白，給藥容量1.00 mL/只）組。腹腔注射給藥致敏，隔天給藥1 次，共3 次。

表1 溶血性試驗加樣

2.3.2 激發(fā)

末次致敏后第14 天，陰性對照組、低劑量組、高劑量組、陽性對照組分別于豚鼠足跖靜脈注射氯化鈉注射液4.00 mL/kg，18.18%（1∶4.5稀釋）痰熱清注射液3.66 mL/kg，33.33%（1∶2稀釋）痰熱清注射液4.00 mL/kg，5%牛血清白蛋白1 mL/只，進行沖擊。并按表2和表3觀察動物注射后30 min內有無抓鼻、豎毛、呼吸困難、痙攣、休克甚至死亡等過敏反應癥狀，判斷過敏反應程度。

3 結果

3.1 血管刺激性實驗

12 只家兔耳緣靜脈注射部位均未見紅腫、充血等刺激現象。光鏡病理組織學檢查顯示，各劑量痰熱清注射液和對照組家兔耳緣靜脈注射部位血管結構完整，血管內皮細胞無腫脹、變性、壞死,，管壁無炎細胞浸潤，管腔內無血栓形成。

3.2 溶血試驗

37 ℃±0.5 ℃恒溫放置3 h 后，7 號管出現澄明紅色，1～6 號管紅細胞呈混懸狀，未見溶血及凝聚現象發(fā)生。1 000 rpm，離心5 min 后，7 號管仍澄明紅色，其他管內上清液無色澄明，表明無溶血現象發(fā)生。

3.3 全身過敏試驗

陽性對照組有2 只豚鼠在致敏期間出現耳輕度紅腫，持續(xù)1 d消失。激發(fā)后陽性對照組出現躁動、顫抖、搔鼻、痙攣等癥狀出現，最后全部死亡，過敏反應呈極強陽性；痰熱清注射液及陰性對照組豚鼠未發(fā)現過敏癥狀即過敏反應陰性。

4 討論

本品的人臨床常用量一般為20 mL，重癥患者一次可用40 mL，按成年人體重60 kg/人計算，其臨床劑量約為0.33 mL 或0.67 mL 原液/kg/d。故本試驗高劑量設為0.667 mL原液/kg，相當于臨床最高劑量；中劑量設為0.333 mL/kg，約為高劑量的1/2，相當于臨床常用量；低劑量設為0.167 mL/kg，約為中劑量的1/2。本實驗采用的方法簡便、準確、可靠，各項指標檢測痰熱清注射液均未出現陽性結果，說明該濃度的痰熱清注射液對血管無刺激性，無溶血作用，全身主動過敏反應呈陰性。

表2 過敏反應癥狀

表3 全身過敏反應評價標準