佟思淼　孟艷秋

摘 ? ? ?要： 以熊果酸為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)并合成其衍生物并檢測(cè)體外抗腫瘤活性。利用熊果酸與各種芳香醛的縮合反應(yīng)， 采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)， 對(duì)設(shè)計(jì)的化合物進(jìn)行篩選;合成分子對(duì)接分最高的的12個(gè)化合物。對(duì)其C-2位Claisen Schmidt 縮合反應(yīng)， C-3位以及C-28位羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造; 采用MTT法測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）和人肺癌細(xì)胞（A549）的體外抗腫瘤活性。目標(biāo)化合物對(duì)這兩種細(xì)胞株的抑制活性均優(yōu)于母體熊果酸，其中化合物Ⅰ6和Ⅱ4表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的熊果酸衍生物具有一定的抗腫瘤活性，值得進(jìn)一步研究。

關(guān) ?鍵 ?詞：熊果酸;結(jié)構(gòu)改造;抗腫瘤活性;分子對(duì)接

中圖分類(lèi)號(hào)：R914.5 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）07-1261-05

Structural Modification and in vitro Antitumor

Activity of Ursolic Acid Analogues

TONG Si-miao， MENG Yan-qiu

（Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang Liaoning 110142， China）

Abstract： Ursolic acid was used as the lead compound， its derivatives were designed and synthesized， and its in vitro antitumor activity was tested. In this paper， the condensation reaction between ursolic acid and various aromatic aldehydes was used to screen the designed compounds by computational aided design.The 12 compounds with the highest molecular score were synthesized.The C-2 Claisen Schmidt condensation reaction， C-3 and C-28 carboxyl groups were modified; The anti-tumor activity of the target compound against human liver cancer cells （HepG2） and human lung cancer cells （A549） in vitro was measured by MTT assay. Inhibitory activity of the target compounds against the two kinds of cell lines was superior to the parent ursolic acid， compoundⅠ6 and Ⅱ4 showed stronger antitumor activity. The structurally modified ursolic acid derivatives have certain antitumor activity and are worthy of further study.

Key words： Ursolic acid; Derivatives; Antitumor activity; Molecular docking

熊果酸是從天然植物中提取出的一種五環(huán)三萜類(lèi)的化合物，具有抗艾滋病[1]、抗白血病[2]、抗糖尿病[3]、抗癌等多種生物學(xué)效應(yīng)，屬于烏蘇烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具備五環(huán)三萜的典型結(jié)構(gòu)及藥理活性。但熊果酸對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，不僅僅能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞十七進(jìn)入凋亡期，更能夠抑制癌細(xì)胞的增值。熊果酸并未成為抗腫瘤的明星藥物，主要原因是因?yàn)槠湓谏矬w中的利用程度較低，使得熊果酸的臨床應(yīng)用和市場(chǎng)發(fā)展遭受很大阻礙。為了更有效地解決這些問(wèn)題，本文通過(guò)分子對(duì)接，設(shè)計(jì)并合成了12個(gè)化合物，并測(cè)得體外抗腫瘤活

性[4-9]。

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者重視細(xì)胞內(nèi)的發(fā)展，也有越來(lái)越多的科學(xué)家開(kāi)始利用細(xì)胞分離增殖。NF-KB（核因子激活的B細(xì)胞的k-輕鏈）是一種存在于所有動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其控制轉(zhuǎn)錄的DNA、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞存活。 NF-KB的不正確調(diào)節(jié)可能會(huì)引起感染性休克，病毒感染和免疫發(fā)育不當(dāng)，也可能會(huì)誘發(fā)癌癥、炎癥和自身免疫性疾病[10-11]。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

本文采用DS4.0，MVD程序，本文設(shè)計(jì)的多個(gè)化合熊果酸類(lèi)化合物與NF-kB晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3rzf）進(jìn)行模擬對(duì)接，其中C-2位與對(duì)硝基苯甲醛、對(duì)氯苯甲醛設(shè)計(jì)連接后的化合物，能與ARG123，LEU386，GLU119和CYS374等關(guān)鍵氨基酸與結(jié)構(gòu)中的配體小分子相結(jié)合。模擬表明，對(duì)接結(jié)果表明（圖1-2）化合物和可以很好地嵌入進(jìn)NF-kB的活性位點(diǎn)，這些表明設(shè)計(jì)的化合物與靶點(diǎn)具有不錯(cuò)的親和力。

化合物Ⅰ6與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接如圖1。

化合物Ⅱ4與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接如圖2。

以UA為原料，在C-3被氧化的條件下，C-2連接對(duì)硝基苯甲醛、對(duì)氯苯甲醛，同時(shí)C-28位與鹵代烷反應(yīng)成脂[12-13]。從母核熊果酸UA到合成熊果酸芐啶衍生物包括3個(gè)步驟，包括Jones氧化、烷基化、和Claisen Schmidt縮合。在冰水浴的條件下，滴加新配置的的瓊斯試劑，用瓊斯試劑應(yīng)得到產(chǎn)率接近98%的C-3氧化衍生物UA1;以UA1為原料，用DMF做溶劑，加入鹵代烷1-6，制備了化合物UA2a-UA2f;以UA2a-UA2f為原料加入叔丁醇鉀和甲苯，再加入對(duì)硝基苯甲醛或?qū)β缺郊兹?，采用Claisen Schmidt縮合法，得Ⅰ1-Ⅰ6或Ⅱ1-Ⅱ6。路線圖見(jiàn)圖3。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?分子對(duì)接

通過(guò)MVD等軟件的篩選， 發(fā)現(xiàn)熊果酸C-2位引入對(duì)硝基苯甲醛和對(duì)氯苯甲醛的時(shí)，氫鍵的作用力明顯高于母體熊果酸的氫鍵作用力，而其中Ⅰ6與Ⅱ4的氫鍵作用力最大。數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2.2 ?化學(xué)合成

以熊果酸（UA）為母體，經(jīng)過(guò)氧化、酯化、羥醛縮合反應(yīng)得到十二個(gè)化合物，目標(biāo)化合物經(jīng)1H NMR以及MS確定，均屬于新化合物。數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.3 ?抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

VP-16和阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照物，采用MTT法測(cè)試目標(biāo)化合物體外抗腫瘤活性[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成出的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中選取的兩種細(xì)胞存在較為明顯的抑制效果，其中化合物I6、II4對(duì)人肝癌細(xì)胞的IC50值分別為8.72、7.12 μM，化合物I6、II4對(duì)人胃癌細(xì)胞的IC50值分別為6.85、9.62 μM。將這些化合物對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞與選取的陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50作比較，兩者基本相同。由此可以斷定產(chǎn)物具有不錯(cuò)的抗腫瘤活性。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

3 ?實(shí)驗(yàn)部分

3.1 ?中間體的合成

氧代-烏蘇烷型-12-烯-28羧酸（UA1）的合成： 將UA（0.5 g 0.99 mmol）加入100 mL茄形瓶中，隨后加入50 mL丙酮溶解UA，先室溫?cái)嚢?.5 h，使其全部溶解。再將其置于冰水中，加入瓊斯試劑，緩慢滴加。滴加完畢，恢復(fù)至室溫，再繼續(xù)反應(yīng)2 h， 薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。展開(kāi)劑：PE/EA=10∶1。監(jiān)測(cè)反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)后，向茄形瓶中加入20 mL異丙醇反應(yīng)45 min淬滅進(jìn)行淬滅處理。先加入乙酸乙酯，再加入飽和食鹽水，進(jìn)行萃取，選取有機(jī)相，加入少量無(wú)水硫酸鎂及無(wú)水硫酸鈉，靜止超過(guò)4 h后，抽濾旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)柱層析得UA1，產(chǎn)率為90.28%， m.p. 233.0～234.4 ℃。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯（UA2a）的合成：將UA1（0.5 g ， 0.98 mmol）和溴乙烷（2 g， 0.017 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)終點(diǎn)后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開(kāi)劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2a。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯（UA2b）的合成：將UA1（0.5 g ， 0.98 mmol）和溴丙烷（2 g， 0.017 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)終點(diǎn)后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開(kāi)劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2b。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯（UA2c）的合成：將UA1（0.5 g， 0.98 mmol）和溴丁烷（2 g， 0.016 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)終點(diǎn)后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開(kāi)劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2c。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸異丁酯（UA2d）的合成：將UA1（0.5 g ， 0.98 mmol）和溴異丁烷

（2 g， 0.016 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)終點(diǎn)后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開(kāi)劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2d。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯（UA2e）的合成：將UA1（0.5 g， 0.98 mmol）和溴戊烷（2 g， 0.015 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)終點(diǎn)后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開(kāi)劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2e。

3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯（UA2f）的合成：將UA1（0.5 g， 0.98 mmol）和溴己烷（2 g， 0.017 mol）溶于20 mL DMF中，0.5 g碳酸鉀做催化劑，常溫反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)終點(diǎn)后，用5%稀鹽酸水洗，加入乙酸乙酯萃取干燥后，柱層析。展開(kāi)劑：PE/EA=15∶1。得白色固體UA2f。

3.2 ?目標(biāo)化合物的合成

2-對(duì)硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯（Ⅰ1）的合成： 首先將第一步生成的UA2a（0.2 g 0.37 mmol）和對(duì)硝基苯甲醛投入50 mL茄形瓶中，并用甲苯將其溶解，加入叔丁醇鉀，在室溫下反應(yīng)6 h，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)介素后，用5%的稀鹽酸酸洗，再用乙酸乙酯萃取。無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水硫酸鈉干燥后，柱層析得到淺黃色固體，洗脫劑：PE/EA=30∶1。產(chǎn)率為63.28%， m.p. 185.1～189.8 ℃。

2-對(duì)硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯（Ⅰ2）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2b 和對(duì)硝基苯甲醛反應(yīng)得到粗品，得到淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=30∶1。產(chǎn)率約為68.91%， m.p. 188.8～192.7 ℃。

2-對(duì)硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯（Ⅰ3）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2c 和對(duì)硝基苯甲醛反應(yīng)得到粗品，淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=30∶1。產(chǎn)率約為63.11%， m.p. 193.1～195.8 ℃。

2-對(duì)硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸異丁酯（Ⅰ4）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2d 和對(duì)硝基苯甲醛反應(yīng)得到，到淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=30∶1。產(chǎn)率約為62.76%， m.p. 192.3～194.8 ℃。

2-對(duì)硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯（Ⅰ5）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2e 和對(duì)硝基苯甲醛反應(yīng)得淺黃色固體。洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=30∶1。產(chǎn)率約為60.30%， m.p. 196.3～201.0 ℃。

2-對(duì)硝基苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯（Ⅰ6）的合成： 按照Ⅰ1 的合成方法，UA2f 和對(duì)硝基苯甲醛反應(yīng)得到淺黃色固體。洗脫劑：PE/EA=40∶1。產(chǎn)率為64.4%，m.p. 198.5～202.1 ℃。

2-對(duì)氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸乙酯（Ⅱ1）的合成： 首先將第一步生成的UA2a（0.2 g 0.37 mmol）和對(duì)氯苯甲醛投入50 mL茄形瓶中，并用甲苯將其溶解，加入叔丁醇鉀，在室溫下反應(yīng)6 h，薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)介素后，用5%的稀鹽酸酸洗，再用乙酸乙酯萃取。無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水硫酸鈉干燥后，柱層析得到淡黃色固體，洗脫劑：PE/EA=25∶1，產(chǎn)率為 產(chǎn)率為67.48%， m.p. 188.9～191.6 ℃。

2-對(duì)氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丙酯（Ⅱ2）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2b 和對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1產(chǎn)率59.03%， m.p. 193.9～196.5 ℃。

2-對(duì)氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸丁酯（Ⅱ3）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2c 和對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)得到淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產(chǎn)率為66.51%，m.p. 198.9～201.7 ℃。

2-對(duì)氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸異丁酯（Ⅱ4）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2d 和對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產(chǎn)率為64.86%，m.p.197.3～199.5 ℃。

2-對(duì)氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸戊酯（Ⅱ5）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2e 和對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產(chǎn)率為60.51%，m.p. 201.4～205.1℃。

2-對(duì)氯苯亞甲基-3-氧代-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸己酯（Ⅱ6）的合成： 按照Ⅱ1 的合成方法，UA2f 和對(duì)氯苯甲醛反應(yīng)得淡黃色固體。洗脫劑：PE/EA=25∶1。產(chǎn)率為63.65%，m.p. 205.9～208.1 ℃。

基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：21372156）;遼寧省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助立項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：LT2017009）;遼寧省教育廳科研項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：LFD2017004）;遼寧省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2019JH2/10300034）。

收稿日期： 2019-10-13

作者簡(jiǎn)介：佟思淼（1994-），錫伯族，女，遼寧沈陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué)。E-mail：tsm0115@qq.com。

通訊作者：孟艷秋（1963-）， 女，遼寧義縣人，博士，教授，研究方向：天然化合物有效成分的結(jié)構(gòu)改造及其抗癌活性的研究、新型半合成抗生素的研究、促智藥的研究。

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