羅文博，付夢(mèng)姣，焦 俊，馮俊霞，盧志宇，胡雪媛，溫博海，趙曉冬，熊小路，周冬生，柯躍華

布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)侵入機(jī)體造成的一種人獸共患病，以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征，對(duì)人和動(dòng)物的生命健康造成了嚴(yán)重威脅[1]。布魯氏菌為兼性的革蘭氏陰性菌[2-4]，毒力主要表現(xiàn)為胞內(nèi)寄生[5]。布魯氏菌可以通過形成布魯氏菌泡(BCV)來避免被溶酶體降解，從而在胞內(nèi)生存和復(fù)制[6]，不會(huì)造成細(xì)胞的程序性死亡[7]。

布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion syster ms，T4SS)是貫穿細(xì)胞壁和外膜的，由12個(gè)基因編碼的蛋白組成的復(fù)合物[8]，是布魯氏菌致病的主要毒力因子。T4SS主要通過分泌蛋白來干擾宿主細(xì)胞的正常功能。其分泌的效應(yīng)蛋白近些年被不斷發(fā)現(xiàn)，目前被報(bào)道的共有15種[9]，大多數(shù)效應(yīng)蛋白的功能和作用機(jī)制未知，BPE043是其中之一。本文研究的BPE043保守區(qū)域?yàn)榄h(huán)狀核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域[10]。其他功能有待研究。

Rab是小G蛋白超家族中最大的旁支，通常被認(rèn)為是信號(hào)調(diào)控的分子開關(guān)，在調(diào)節(jié)囊泡的形成、?？亢娃D(zhuǎn)移方面起調(diào)節(jié)作用[11]。Rab蛋白在布魯氏菌感染細(xì)胞后形成的BCV中被發(fā)現(xiàn)[12]。本研究以布魯氏菌野生株104為起始菌株，構(gòu)建了BPE 043基因的缺失株，通過進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定、小鼠感染能力測(cè)定以及篩選有可能與BPE043有相互作用的宿主蛋白等，初步研究了BPE043蛋白的功能，為進(jìn)一步研究BPE043在布魯氏菌感染過程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 羊種布魯氏菌104株由中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心保存，布魯氏菌BPE 043基因突變株由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 試劑 布魯氏菌培養(yǎng)基Bucella Broth和Bucella Broth Agar購自BD公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自AOBOX公司;PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase、Clon ExpressTMMulti S重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;基因組提取試劑盒購自QIAGEN公司;感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自天根生化科技有限公司(北京);抗體購自Cell Signaling Technology(CST)公司;轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofecta mine 3000 Transf ection Kit購自invitrogen;免疫共沉淀試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取30只SPF級(jí)的BALB/c小鼠，均為雌性，6周齡。購于北京維通利華公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物合成 本實(shí)驗(yàn)所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 布魯氏菌BPE 043基因突變株載體構(gòu)建所需引物Tab.1 Primers for constr uction of BPE 043 gene mutant vector of Brucella

1.2.2 布魯氏菌BPE 043基因突變株載體的構(gòu)建根據(jù)BPE 043基因兩端的序列設(shè)計(jì)N端和C端的同源臂引物。然后以羊種布魯氏菌野生株104的序列為模板，以BPE 043-N-F、BPE 043-N-R引物和BPE 043-C-F、BPE 043-C-R引物分別擴(kuò)增BPE 043基因N端和C端的同源臂。以卡那霉素表達(dá)質(zhì)粒p UC19質(zhì)粒為模板，用引物KANA-F和KANA-R擴(kuò)增卡納抗性基因。將獲得的BPE 043左右同源臂和卡那片段進(jìn)行純化，利用同源重組試劑盒將純化片段連入載體p MD-18 T。將載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α。在卡那平板上進(jìn)行篩選后，提質(zhì)粒測(cè)序鑒定。質(zhì)粒命名為p MD-18T-BPE 043-K。

1.2.3 布魯氏菌BPE 043基因突變株的構(gòu)建 將質(zhì)粒p MD-18 T-BPE 043-K電轉(zhuǎn)化到羊種布魯氏菌野生株104的感受態(tài)細(xì)胞中。接種進(jìn)行活化后，涂布于卡那抗性的布魯氏菌TSA固體平板上進(jìn)行篩選，將疑似陽性克隆用卡那替換目的基因的內(nèi)引物和外引物進(jìn)行PCR鑒定。將陽性克隆命名為104ΔBPE 043。

1.2.4 突變株與野生株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化后的羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043各取2μL分別接種于10 mL布魯氏菌液體培養(yǎng)基中。在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液稀釋到OD600為0.2。在37℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每1 h取樣一次測(cè)OD值，每個(gè)樣品做3次重復(fù)取均值。直到進(jìn)入平臺(tái)期。繪制104和104ΔBPE 043的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 小鼠感染試驗(yàn) 將30只雌性、6周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組，分別接種羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043(腹腔注射)。接種劑量為1×106cf u/只。2組小鼠分別在接種后的1至5周每周處死3只，測(cè)量脾臟重量。剪取0.05 g脾臟于EP管中加800μL的PBS進(jìn)行研磨，進(jìn)行合適倍數(shù)的稀釋后進(jìn)行涂板。37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.6 免疫共沉淀尋找布魯氏菌效應(yīng)蛋白BPE043的互作蛋白 將鼠源Rab3、Rab 4、Rab 8、Rab 11、13、Rab 14、Rab 35基因克隆至含有Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體上，構(gòu)建 Flag-Rab 3、Flag-Rab4、Flag-Rab 8、Flag-Rab 11、Flag-Rab 13、Flag-Rab 14、Flag-Rab 35重載質(zhì)粒。再將BPE 043基因克隆至含有Myc標(biāo)簽的真核表達(dá)載體上，構(gòu)建Myc-BPE 043重載質(zhì)粒。所有重組質(zhì)粒均由北京擎科生物科技有限公司合成。用Lipof-ecta mine 3000 Transfection Kit試劑盒在HeLa細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染Myc-BPE 043 和 Flag-Rab 3、Flag-Rab 4、Flag-Rab 8、Flag-Rab 11、Flag-Rab 13、Flag-Rab 14、Flag-Rab 35等質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度為1 000 ng/mL。轉(zhuǎn)染后24 h去掉培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗滌，再用胰蛋白酶處理，3 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。去掉上清，加細(xì)胞裂解液和SDS×Loading Buffer。離心后得到上清液。留取少量上清液，其他用免疫共沉淀試劑盒處理(加入抗Myc抗體)，得到免疫沉淀物。通過Wester n Blotting來檢測(cè)上清液和免疫沉淀物中的Myc和Flag標(biāo)記。

2 結(jié) 果

2.1 p MD-18T-BPE 043-K自殺載體的構(gòu)建與鑒定以羊種布魯氏菌野生株104為模板，分別用以引物 BPE 043-N-F、BPE 043-N-R 和 BPE 043-C-F、BPE 043-C-R擴(kuò)增BPE 043基因兩端的同源臂;以質(zhì)粒p UC19為模板，用引物KANA-F和KANA-R擴(kuò)增卡那抗性基因片段。BPE 043基因兩端同源臂以及卡那抗性基因片段的大小均與預(yù)期一致。用同源重組試劑盒將同源臂和卡納基因純化片段連接載體質(zhì)粒p MD-18T，獲得重組質(zhì)粒p MD-18TBPE 043-K。以重組質(zhì)粒為模板，BPE 043-N-F、BPE 043-C-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為600 bp左右的片段，與預(yù)期一致。

2.2 布魯氏菌BPE 043基因突變株的構(gòu)建與鑒定將重組質(zhì)粒p MD-18 T-BPE 043-K轉(zhuǎn)入DH5α中，擴(kuò)大培養(yǎng)，用卡那平板篩選后，以BPE 043-N-F、BPE 043-C-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得片段大小為600 bp左右，與預(yù)期一致。提取質(zhì)粒后，電轉(zhuǎn)到羊種布魯氏菌野生株104中。發(fā)生同源重組后，用卡那平板篩選疑似陽性克隆，用內(nèi)引物N-I-F、N-IR和C-I-F、C-I-R分別擴(kuò)增野生株104以及疑似同源重組陽性菌株。野生株擴(kuò)增結(jié)果為陰性，疑似陽性克隆N端和C端擴(kuò)增分別獲得大小為163 bp和128 bp的片段，與預(yù)期一致(圖1)。104ΔBPE 043構(gòu)建成功。

2.3 突變株與野生株的生長(zhǎng)曲線分析 將OD600稀釋為0.2的羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043繼續(xù)在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，每隔1 h取樣測(cè)OD值，連續(xù)取樣20 h，繪制生長(zhǎng)曲線如圖2?？梢娫? h到12 h之間突變株濃度略低于野生株，其他時(shí)間段兩菌濃度基本一致。突變株與野生株總體生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同。表明BPE 043基因的缺失并不會(huì)對(duì)布魯氏菌的生長(zhǎng)情況造成顯著的影響。

2.4 小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn) 用羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043分別對(duì)2組小鼠進(jìn)行腹腔注射1×106cf u/只劑量后，1周后可以在脾臟中檢測(cè)到布魯氏菌。比較第1到5周2組小鼠脾臟重量和脾細(xì)菌載量。結(jié)果顯示，第1周2組小鼠脾均腫大，但突變株104ΔBPE 043感染組小鼠體重低于野生株104感染組。第2周2組小鼠脾重均達(dá)到最大。之后2組小鼠脾重均開始下降，突變株104ΔBPE 043感染組下降速度較快。2組差值逐漸增大(圖3 A);在脾細(xì)菌載量方面，第1周2組小鼠脾細(xì)菌載量均達(dá)到最高值，且突變株104ΔBPE 043感染組低于野生株104感染組。第2周2組小鼠脾細(xì)菌載量均下降，二者差值依然較大。之后3到5周野生株104感染組脾細(xì)菌載量基本維持不變，而突變株104ΔBPE 043感染組脾細(xì)菌載量快速下降(圖3B)。結(jié)果表明BPE043的缺失降低了布魯氏菌在小鼠體內(nèi)的毒力，也降低了其在體內(nèi)的復(fù)制能力。

圖1 PCR驗(yàn)證B.melitensisΔBPE 043突變株結(jié)果Fig.1 Test of B.melitensisΔBPE 043 mutant strain by PCR

圖2 104,104ΔBPE 043生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig.2 Growth of the 104,104ΔBPE 043

圖3 布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn)中脾臟重量(A)和脾細(xì)菌載量(B)分析Fig.3 Analysis of the weight(A)and the bacterial load(B)bet wween WT 104 and 104ΔBPE 043 in the spleen

2.5 免疫共沉淀篩選布魯氏菌效應(yīng)蛋白BPE043的互作蛋白 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收取樣品，獲得上清液;留存少量上清液后，其他部分用免疫共沉淀試劑盒(加入抗Myc抗體)處理得到免疫沉淀物。用Wester n Blotting分別檢測(cè)各樣品的上清液和免疫沉淀物中的Myc和Flag標(biāo)記。結(jié)果如圖4。各樣品上清液中Myc和Flag檢測(cè)均為陽性，說明各質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，可排除后續(xù)結(jié)果中的假陽性;以藕聯(lián)Myc抗體的填料對(duì)樣品進(jìn)行免疫共沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)免疫共沉淀。結(jié)果顯示所有樣品Myc檢測(cè)全部為陽性，說明Myc-BPE043蛋白被成功沉淀下來。Flag檢測(cè)顯示只有 Myc-BPE043、Flag-Rab4和 Myc-BPE043、Flag-Rab11轉(zhuǎn)染組為陽性，說明BPE043和Rab4、Rab11存在相互作用。

圖4 免疫共沉淀篩選BPE043互作蛋白Fig.4 Screening protein interactions of BPE043 by co-immunoprecipitation

3 討 論

布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion syster ms，T4SS)由vir B操縱子調(diào)控，參與布魯氏菌感染宿主后的胞內(nèi)活動(dòng)。T4SS組裝完成后，布魯氏菌即可通過T4SS分泌效應(yīng)蛋白來感染宿主細(xì)胞[13]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了15個(gè)由T4SS分泌的效應(yīng)蛋白[9]。其中VirB調(diào)控的效應(yīng)物A(Vce A)和效應(yīng)物C(VceC)是最早發(fā)現(xiàn)的2個(gè)效應(yīng)蛋白[14]。BPE043和BPE123、BPE005等是另一部分T4SS分泌的蛋白，具有高度保守性[15]。但對(duì)其功能和作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究對(duì)BPE 043基因在布魯氏菌感染和胞內(nèi)生存過程中的功能做了初步探索。

研究基因的功能常用到基因敲除的方法。其中同源重組因其可以精準(zhǔn)替換目的基因且遺傳穩(wěn)定，是基因敲除中最常用方法。本研究中以羊種布魯氏菌104為模板，通過同源重組構(gòu)建了布魯氏菌BPE 043基因缺失株，進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線和小鼠體內(nèi)感染的測(cè)度，篩選了宿主細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白，初步說明了BPE 043基因在布魯氏菌感染和胞內(nèi)生存過程中起重要作用。

生長(zhǎng)曲線測(cè)定試驗(yàn)顯示，在0到20 h測(cè)定時(shí)間內(nèi)，羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE 043的生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同。只有在8～12.5 h之間，突變株的細(xì)菌濃度略低于野生株。兩者差值很小。這有可能與試驗(yàn)偶然性有關(guān)?；究梢哉J(rèn)為BPE 043基因的缺失不會(huì)影響布魯氏菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn)顯示，羊種布魯氏菌野生株104和突變株104ΔBPE043感染小鼠后均會(huì)在1周后檢測(cè)到小鼠脾臟重量的升高，說明它們均有致病性，會(huì)引起小鼠脾臟的腫大。但野生株感染組小鼠脾臟重量的上升高于突變株感染組，且2周后突變株感染組小鼠脾臟重量持續(xù)下降;同樣，突變株感染組小鼠脾細(xì)菌載量2周后快速下降，而野生株感染組在感染2周以后下降速度變緩，且野生株感染組脾細(xì)菌載量全程高于突變株感染組。說明BPE043在布魯氏菌對(duì)小鼠進(jìn)行體內(nèi)持續(xù)感染的過程中起重要作用。該基因的缺失對(duì)布魯氏菌的毒力影響非常顯著。

免疫共沉淀試驗(yàn)顯示，在將帶有Myc標(biāo)簽的BPE043和帶有Flag標(biāo)簽的相關(guān)Rab蛋白成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，使用Myc抗體對(duì)Myc-BPE043蛋白進(jìn)行吸附，檢測(cè)結(jié)果全部為陽性。在對(duì)Flag的檢測(cè)中，只有Rab4和Rab11為陽性。說明二者與BPE043存在相互作用。Rab相關(guān)蛋白在布魯氏菌感染宿主形成的BCV中被發(fā)現(xiàn)[12]，本試驗(yàn)說明BPE043和Rab4、BPE043和Rab11 2對(duì)互作蛋白很可能在BCV的形成以及逃避宿主的免疫機(jī)制方面起一定的作用。值得注意的是，試驗(yàn)中Rab8和Rab13的陽性結(jié)果不是很明顯，其是否與BPE043存在相互作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明BPE 043基因不會(huì)影響布魯氏菌體外的生長(zhǎng)特性，但對(duì)于布魯氏菌對(duì)宿主的感染和胞內(nèi)生存有重要作用。并確定了與BPE043存在相互作用的蛋白R(shí)ab4和Rab11。為進(jìn)一步研究BPE043在布魯氏菌中的功能和致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。