宋易洋,李桂秀,趙 芯,王國(guó)良

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,北京 100097)

南極是地球上的極端地區(qū)之一,其惡劣的生境條件孕育了特殊的土壤微生物類群[1-2]．南極地區(qū)獨(dú)特的地理位置和環(huán)境特征使大量土壤資源未被開(kāi)發(fā),其中包括許多具有特殊生理生化特性和分子生物學(xué)機(jī)制的微生物資源,例如大量具有耐/嗜鹽、耐/嗜冷、抗輻射等特性的微生物[3]．

自然界中的微生物只有很小一部分可在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng),因此土壤菌株的分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法描述土壤樣品中微生物的多樣性及物種之間的差異和相互作用關(guān)系[4]．近年來(lái),隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展,宏基因組測(cè)序成為可能[5]．應(yīng)用這種免培養(yǎng)的新技術(shù),理論上可以獲得樣本中微生物的全部DNA信息,并且可以跳過(guò)微生物分離培養(yǎng)的過(guò)程,直接在基因水平揭示微生物的多樣性與豐度,深入了解微生物的功能和相互作用,有助于進(jìn)一步了解微生物群落的功能活動(dòng)規(guī)律和遺傳潛力[6-7]．本研究以南極土壤為樣本,采用宏基因組測(cè)序結(jié)果分析樣本中微生物的多樣性,為后續(xù)南極土壤微生物資源的開(kāi)發(fā)和保護(hù)提供技術(shù)支持．

1 材料與方法

1.1 土壤樣本采集

實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)自中國(guó)第31次南極科學(xué)考察(2014年10月30日出發(fā)),采樣區(qū)域?yàn)槔娣茽柕聧u,采樣時(shí)間為2015年2月3日．所有樣本低溫條件運(yùn)輸至國(guó)內(nèi),實(shí)驗(yàn)前在-80 ℃條件下儲(chǔ)藏于中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所．樣本相關(guān)信息見(jiàn)表1．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 使用電子天平稱取3例南極土壤樣本各0.1 g,使用試劑盒(江蘇康為世紀(jì), cw2091s)對(duì)樣本進(jìn)行基因組提取．

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) 宏基因組DNA的純度和完整性檢測(cè)分別通過(guò)NanoDrop微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠水平電泳完成,DNA質(zhì)量濃度通過(guò)Qubit檢測(cè)獲得．

表1 南極土壤樣本位點(diǎn)信息

1.2.3 文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序 采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序,需要對(duì)提取的宏基因組樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建．取10 ng 基因組DNA起始建庫(kù),利用自動(dòng)聚焦聲波基因組剪切儀Covaris M220將gDNA打斷成200 bp左右的片段．使用1.8×DNA 純化磁珠(Vazyme, N411)純化片段化產(chǎn)物,使用諾唯贊建庫(kù)試劑(Vazyme, ND607)進(jìn)行建庫(kù)實(shí)驗(yàn)．分別用全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)Qsep100和熒光定量PCR(BioRad, CFX96)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢以確定其片段分布及質(zhì)量濃度．質(zhì)檢合格的文庫(kù)由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序,測(cè)序基于Illumina NovaSeq 6000平臺(tái),測(cè)序策略為Paired-end 150 bp．

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)中,會(huì)帶有接頭序列或少量低質(zhì)量的序列．使用FastQC對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,生成質(zhì)檢報(bào)告．根據(jù)質(zhì)檢報(bào)告結(jié)果使用Trimmomatic[8]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,以去除接頭序列等低質(zhì)量數(shù)據(jù)．然后使用MetaPhlAn2[9]進(jìn)行后續(xù)分析,通過(guò)快速比對(duì)準(zhǔn)確估計(jì)物種的相對(duì)豐度,得到微生物群落組成信息[10]．使用GraPhlAn基于分類等級(jí)繪制可視化進(jìn)化樹(shù),構(gòu)建物種群落結(jié)構(gòu)圖[11]．

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組提取結(jié)果

由圖1可見(jiàn),3例宏基因組DNA樣本主帶均在10 kb以上且無(wú)明顯雜帶或降解.NanoDrop測(cè)得吸光度A260/A280(表2)均分布于1.8～2.0,說(shuō)明純度符合實(shí)驗(yàn)要求.基于Qubit Assay測(cè)得的DNA質(zhì)量濃度(表2)進(jìn)行后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建．

2.2 文庫(kù)構(gòu)建結(jié)果

如圖2所示,經(jīng)Qsep100檢測(cè)得到3例樣本的文庫(kù)片段分布．文庫(kù)分布于300～500 bp范圍內(nèi),峰值分別為404、411、409 bp,無(wú)引物二聚體污染,質(zhì)量符合上機(jī)要求,將文庫(kù)進(jìn)行二代高通量測(cè)序．

2.3 測(cè)序與數(shù)據(jù)分析結(jié)果

下機(jī)數(shù)據(jù)詳細(xì)信息見(jiàn)表3．使用MetaPhlAn2對(duì)3個(gè)樣本的微生物群落組成進(jìn)行分析,獲得微生物多樣性豐度匯總表(表4)和相對(duì)豐度熱圖(圖3)．由圖3可知,樣本S14、S16、S22均有明顯的黑色區(qū)域,這些黑色區(qū)域所覆蓋的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較大,且3個(gè)樣本均具有不同的白色區(qū)域,從整體上看,樣本間的差異性較大．群落間豐度分析顯示:3個(gè)位點(diǎn)的土壤樣本中既存在大量共有的土壤微生物類群,也存在一定比例的特有微生物類群．S14樣本細(xì)菌豐度占91.31%,優(yōu)勢(shì)菌屬是顆粒菌屬(Granulicella),占比為40.81%．S16樣本細(xì)菌豐度占89.56%,優(yōu)勢(shì)菌屬是羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter),占比為24.37%．與S14和S22相比,S16樣本中的特有菌屬是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)． S22樣本細(xì)菌豐度占59.84%,真菌豐度占40.16%,優(yōu)勢(shì)菌種是白色念珠菌(Candidaalbicans)．與S14和S16相比,S22樣本中的特有菌種是Rickettsiabellii．

表2 NanoDrop和Qubit檢測(cè)基因組DNA結(jié)果

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表4 微生物多樣性分析結(jié)果

表4(續(xù))

使用GraPhlAn生成物種群落結(jié)構(gòu)圖(圖4),圖4中從內(nèi)而外的節(jié)點(diǎn)依次代表界門(mén)綱目科屬種,節(jié)點(diǎn)越大,豐度越高．陰影區(qū)域表示不同目下的分類,同一目中的不同區(qū)域代表不同的科屬種．圖4中包含所有樣本中相對(duì)豐度大于1%的15個(gè)目,從字母AB所屬目為始,按逆時(shí)針順序排列,分別為:酸桿菌目Acidobacteriales 、放線菌目Actinomycetales 、土壤紅桿菌目Solirubrobacterales、噬纖維菌目 Cytophagales 、鞘脂桿菌目Sphingobacteriales、酵母目Saccharomycetales、Viruses noname、根瘤菌目Rhizobiales、柄桿菌目Caulobacterales 、立克次氏體目Rickettsiales、伯克氏菌目Burkholderiales、亞硝化單胞菌目Nitrosomonadales、腸桿菌目Enterobacteriales、假單胞菌目Pseudomonadales、黃單胞菌目Xanthomonadales．由圖4可知,不同物種的豐度差異較大,酸桿菌目Acidobacteriales的物種豐度最高．

3 討 論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)南極3個(gè)不同位點(diǎn)的土壤微生物多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明3個(gè)樣本間的微生物種群豐度差異較大,優(yōu)勢(shì)菌屬和特殊菌屬各有不同．S14樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬是顆粒菌屬(Granulicella),Granulicella在贛南臍橙黃龍病植株和健康植株中都是優(yōu)勢(shì)菌屬,并且是不可培養(yǎng)菌屬[12]．S16樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬是羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter),在低pH的條件下,Rhodanobacter的反硝化細(xì)菌在地下污染嚴(yán)重的地區(qū)占主導(dǎo)地位,Rhodanobacter是耐酸的反硝化劑[13]．S16樣本中的特有菌屬是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),氨氧化細(xì)菌在硝化過(guò)程中起重要作用,Nitrosospira主導(dǎo)土壤中的氨氧化群落[14]．S22樣本的優(yōu)勢(shì)菌種是白色念珠菌(Candidaalbicans),Candidaalbicans是一株致病菌,它可以進(jìn)入血液引起全身性疾病,幾乎可以感染宿主的所有組織[15]．S22樣本中的特有菌種是Rickettsiabellii,Rickettsiabellii是一種專性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,是少數(shù)編碼與細(xì)胞接合轉(zhuǎn)移遺傳元件相關(guān)的基因的立克次氏體之一[16-17]．

MetaPhlAn2可以基于宏基因組數(shù)據(jù),精確到微生物群體中種的構(gòu)成,包括細(xì)菌、古菌、真核生物和病毒．若數(shù)據(jù)庫(kù)中有株水平的基因組,也可以獲得更加深入的研究．MetaPhlAn2整理了超過(guò)17 000個(gè)參考基因組,包括13 500個(gè)細(xì)菌和古菌,3 500個(gè)病毒和110個(gè)真核生物．MetaPhlAn2可以準(zhǔn)確估計(jì)物種的相對(duì)豐度并鑒定到種,本研究中的部分微生物序列只鑒定到屬,未精確到種,可能的原因是數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有該微生物種水平的基因組數(shù)據(jù),可以推測(cè)該微生物具有新種的可能性,側(cè)面說(shuō)明南極土壤中新種存在率高,具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值．研究表明,由于MetaPhlAn2具有更完善的病毒、真核生物和原核生物數(shù)據(jù)庫(kù),MetaPhlAn2比MetaPhlAn、mOTU[18]、Kraken[19]得到的分析結(jié)果更準(zhǔn)確．

南極地區(qū)土壤樣本由于位置特殊,運(yùn)輸至國(guó)內(nèi)必須經(jīng)過(guò)低溫冷藏,很難實(shí)現(xiàn)對(duì)新鮮樣本進(jìn)行微生物群落分析．本實(shí)驗(yàn)通過(guò)宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)冷凍后的土壤樣本中的微生物群落構(gòu)成信息進(jìn)行鑒定,為南極土壤微生物資源開(kāi)發(fā)提供了信息儲(chǔ)備和技術(shù)支持．

當(dāng)前對(duì)微生物互作的代謝調(diào)控通路分析和構(gòu)建多數(shù)是基于單一種群,但自然界中微生物群落是以復(fù)雜多樣的整體形式存在的．因此將微生物種群進(jìn)行整體代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和通路的分析研究甚至加以改造和利用將是一個(gè)新的發(fā)展方向．高速發(fā)展的宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)和分析手段為有效探索微生物群落的種群構(gòu)成和互相作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持．