龍須菜栽培與遺傳育種*

隋正紅, 胡依依, 周 偉, 張敬宇

(1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005；3. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 連云港 222005；4. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222005)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)是紅藻門(Rhodophyta)江蘺科(Gracilariaceae)的一類重要的產(chǎn)瓊膠海藻，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015年世界瓊膠產(chǎn)量的91%來(lái)自龍須菜/江蘺屬海藻等[1]。龍須菜富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、微量元素、礦物質(zhì)等，并且脂肪含量相對(duì)較低，因此可以作為一種理想的綠色食物，其所含藻膽蛋白、多糖具有增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤的功效[2-3]。另外，新鮮的龍須菜還富含?；撬岷凸劝彼?，廣泛用作鮑魚(yú)的餌料[4-5]。根據(jù)栽培面積數(shù)據(jù)，以龍須菜為代表的江蘺栽培已成為中國(guó)第二大海藻栽培產(chǎn)業(yè)。

龍須菜生長(zhǎng)迅速，在增殖過(guò)程中吸收大量氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素，因此其不僅具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，還具有重要的生態(tài)效益，能有效改善水域環(huán)境，可用于構(gòu)建海洋牧場(chǎng)和水體多營(yíng)養(yǎng)層次綜合養(yǎng)殖等生態(tài)系統(tǒng)。本文對(duì)龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、瓊膠合成途徑和誘變育種進(jìn)行了綜述，對(duì)產(chǎn)業(yè)存在的問(wèn)題和未來(lái)發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 龍須菜栽培

1.1 技術(shù)進(jìn)步歷史

龍須菜/江蘺在中國(guó)的人工栽培從無(wú)至有發(fā)展迅速，最早可追溯至1950年代，1970年代探索出的江蘺半人工育苗和網(wǎng)簾夾苗栽培技術(shù)，1980年代成功應(yīng)用的“全浮筏式”栽培技術(shù)，是極大促進(jìn)江蘺栽培發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)步[6]。

為提升龍須菜栽培效率，栽培模式的優(yōu)化至關(guān)重要。Yang等[7]在青島膠州灣比較研究了水平掛養(yǎng)和垂直掛養(yǎng)兩種栽培方式及栽培水層對(duì)龍須菜生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)水平掛養(yǎng)較好，垂直掛養(yǎng)中龍須菜生長(zhǎng)受水層影響較為明顯。目前龍須菜主要采取營(yíng)養(yǎng)繁殖，通過(guò)藻段夾苗、水平掛養(yǎng)、“全浮筏式”栽培。營(yíng)養(yǎng)繁殖是直接利用收獲藻體的一部分作為苗種的栽培方式，雖可以節(jié)省和減少育苗的時(shí)間、空間、設(shè)施等投入與需求，但也存在很大弊端[8-9]。近年來(lái)，基于有性生殖，通過(guò)采孢子育苗進(jìn)行龍須菜栽培的方式已獲得小規(guī)模試驗(yàn)成功[8-9]。新的栽培模式及其成熟將進(jìn)一步提升栽培效率。

野生型龍須菜的適溫范圍是12～23 ℃，龍須菜栽培的適宜溫度是12～26 ℃[10]。因此在北方較為適宜的栽培時(shí)間為5月中下旬到11月中旬，在南方是11月中旬至次年5月中旬，中國(guó)南北方適宜栽培時(shí)間恰好覆蓋全年。龍須菜南移栽培思路的施行[10]，形成了“南用北調(diào)”、“北用南調(diào)”的南北互調(diào)種苗的格局，實(shí)現(xiàn)了全國(guó)范圍內(nèi)的全年栽培，促進(jìn)了龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1.2 栽培產(chǎn)業(yè)分布與規(guī)模

2003年，江蘺栽培的規(guī)模及年產(chǎn)量數(shù)據(jù)被收錄至《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局，2004—2019)[11]，統(tǒng)計(jì)表明(見(jiàn)圖1)：江蘺栽培面積和產(chǎn)量在2003年是40 km2和5萬(wàn)t干品，到2018年分別達(dá)到90 km2和30萬(wàn)t干品；2010年以后，累計(jì)栽培面積及產(chǎn)量分別為1 126.67 km2和2 856 465 t；自2013年后中國(guó)江蘺年產(chǎn)量突破20萬(wàn)t，值得注意的是栽培面積自2016年接近100 km2后不再增長(zhǎng)。這些變化情況說(shuō)明：從2003—2018年全國(guó)江蘺栽培產(chǎn)量呈整體上升趨勢(shì)，栽培規(guī)模除在少數(shù)年份，如2007、2017年呈現(xiàn)明顯下滑外，均是不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)；2010年以后線性上升趨勢(shì)更為明顯，龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)前景看好。而栽培面積變化趨勢(shì)也暗示了栽培面積的飽和。

(作圖數(shù)據(jù)引自《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》2004—2019[11] 。Data quoted from “China Fishery Statistics Yearbook 2004—2019”[11].)

《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[11]數(shù)據(jù)顯示(見(jiàn)圖2)：栽培規(guī)模較大的省份是福建、廣東和海南，福建省江蘺栽培規(guī)模發(fā)展迅速，呈逐年上升的趨勢(shì)，且增幅顯著，海南省與廣東省江蘺栽培面積多年來(lái)保持在較為平穩(wěn)的水平。近年來(lái)，隨著栽培面積的擴(kuò)大，“北苗南用”的栽培需要，自2013年山東省江蘺栽培也開(kāi)始占有較大份額，成為江蘺栽培大省。2003年全國(guó)江蘺的產(chǎn)量以廣東和海南省為主，兩省栽培產(chǎn)量占全國(guó)87%；福建省自2004年開(kāi)始大面積栽培江蘺，產(chǎn)量逐年提高，至2018年產(chǎn)量突破22萬(wàn)t，是2003年全國(guó)江蘺總產(chǎn)量的4倍(見(jiàn)圖3)。

從栽培規(guī)模和產(chǎn)量來(lái)看，中國(guó)江蘺的人工栽培主要集中在南方，北方相對(duì)較少，從2018年開(kāi)始江蘺栽培分布在福建、山東、廣東和海南四省，沿中國(guó)海岸線，栽培分布具有明顯不均衡性(見(jiàn)圖2、3)。

(作圖數(shù)據(jù)引自《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》2004—2019[11] 。Data quoted from “China Fishery Statistics Yearbook”2004—2019[11].)

(作圖數(shù)據(jù)引自《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》2004—2019[11] 。Data quoted from “China Fishery Statistics Yearbook” 2004—2019[11].)

1.3 栽培對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響

研究顯示，每產(chǎn)出3.5 t干重海藻，將利用1.27 t碳(C)、0.22 t氮(N)和 0.03 t磷(P)，具有良好的生態(tài)環(huán)境效益。鄭兵研究了龍須菜養(yǎng)殖與廣東深澳灣環(huán)境因子的變化特征，結(jié)果顯示龍須菜養(yǎng)殖能夠有效的吸收海水中的氨態(tài)氮和無(wú)機(jī)磷[12]。研究發(fā)現(xiàn)龍須菜對(duì)赤潮藻的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，可以有效降低赤潮藻物種的豐度[13-14]。龍須菜在生長(zhǎng)過(guò)程中可以吸收周圍水體的C、N、P等，防止海水的富營(yíng)養(yǎng)化，對(duì)海水的凈化與生物修復(fù)有著不可替代的作用[15-18]。

Zhou等[14]建立了龍須菜與黑鮶(Sebastodesfuscescens)共養(yǎng)體系，對(duì)5組處理體系中營(yíng)養(yǎng)鹽的變化進(jìn)行定時(shí)檢測(cè)，數(shù)據(jù)顯示藻體生長(zhǎng)吸收大量營(yíng)養(yǎng)鹽，生物量的變化與營(yíng)養(yǎng)鹽之間存在相關(guān)性。Wei等[19]報(bào)道了在鹽田灣進(jìn)行的龍須菜與牡蠣混養(yǎng)的“生物提取”效果，顯示了混養(yǎng)體系在硫抽取與降低富營(yíng)養(yǎng)狀況方面的重要價(jià)值。馬來(lái)西亞學(xué)者也研究了江蘺G.edulis和G.changii對(duì)養(yǎng)蝦廢水的凈化效應(yīng)[20]。龍須菜養(yǎng)殖越來(lái)越顯示其生態(tài)友好的特性而應(yīng)用于與動(dòng)物的混養(yǎng)和緩解海區(qū)富營(yíng)養(yǎng)狀況的實(shí)踐中。

1.4 新品種培育與特性

栽培龍須菜已初步實(shí)現(xiàn)良種化。迄今為止，中國(guó)成功選育的龍須菜國(guó)家級(jí)水產(chǎn)品種已有3個(gè)，分別為：1998年審定通過(guò)的龍須菜“981”，2014年審定通過(guò)的龍須菜“2007”和2015年審定通過(guò)的龍須菜“魯龍1號(hào)”。三個(gè)品種均是以DNA序列的非定向改變?yōu)榛A(chǔ)，并通過(guò)人工選育，篩選出的性狀優(yōu)良且遺傳穩(wěn)定的四分孢子體，因其在生長(zhǎng)、抗逆等經(jīng)濟(jì)性狀上的優(yōu)良表現(xiàn)，成為規(guī)?；耘嗟氖走x[10,21-24]。

“981”龍須菜，具有耐高溫、抗逆速生、瓊膠含量高、質(zhì)量好等特點(diǎn)[10, 25]，在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)是唯一在應(yīng)用的良種?！?007”是以“981”為出發(fā)材料經(jīng)誘變選育的良種，在耐受高溫、瓊膠含量和品質(zhì)等方面均比出發(fā)材料有提升[21, 26]。而隨著栽培海域的拓展與產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)新品種提出了更多要求。“魯龍1號(hào)”彈性大，抗風(fēng)浪能力強(qiáng)，尤其是生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，產(chǎn)量比傳統(tǒng)栽培品種提高 15%～30%，蛋白含量比傳統(tǒng)品種增加約 12%[22, 24]。值得注意的是全國(guó)江蘺栽培面積自2016年接近100 km2后不再增長(zhǎng)，而產(chǎn)量并不減少，同樣栽培面積從2014年起增長(zhǎng)緩慢，而產(chǎn)量的增長(zhǎng)速度遠(yuǎn)超栽培面積增長(zhǎng)(見(jiàn)圖2、3)，這個(gè)節(jié)點(diǎn)與新品種“魯龍1號(hào)”的應(yīng)用高度吻合。良種的推廣應(yīng)用極大提高了產(chǎn)量和品質(zhì)，惠及廣大養(yǎng)殖群體。

2 龍須菜遺傳育種

2.1 瓊膠合成途徑解析

瓊膠是一種重要的工業(yè)和食用原料，是龍須菜/江蘺的重要代謝產(chǎn)物。因此對(duì)瓊膠代謝途徑的研究是龍須菜經(jīng)濟(jì)性狀解析的重要方面。在紅藻中紅藻淀粉和瓊膠均位于代謝通路的末端，因此二者都是碳的儲(chǔ)存形式。并且在紅藻淀粉和瓊膠的合成的代謝通路上，二者對(duì)底物UDP-葡萄糖具有一定的競(jìng)爭(zhēng)性。瓊膠合成后不分解，是一種穩(wěn)定的碳儲(chǔ)存物質(zhì)，但紅藻淀粉又可以分解為Glucose-1-P和Glucose-6-P，用來(lái)合成新一輪的淀粉和瓊膠。許多學(xué)者根據(jù)同位素示蹤技術(shù)構(gòu)建了紅藻瓊膠和淀粉的代謝通路[27-29](見(jiàn)圖4)。

(1. 甘露糖磷酸異構(gòu)酶；2. GTP-甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)嘌呤基轉(zhuǎn)移酶；3. GDP-D-甘露糖-表異構(gòu)酶；4. 葡萄糖磷酸變位酶；5. UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；6. 半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶；7. 淀粉合酶。1. Mannose-6-phosphate isomerase, pmi; 2. Mannose-1-phosphate guanylyltransferase, mpg; 3. GDP-mannose- 3′,5′-epimerase, gme; 4. Phosphoglucomutase, pgm; 5. UDP-glucose pyrophosphorylase, glup; 6. Galactose-1-phosphate uridylyltransferase, galt; 7. Starch synthase, fss.)

在龍須菜中是否也存在這一瓊膠代謝通路呢？一系列研究報(bào)道了龍須菜中上述代謝通路中基于單基因表達(dá)量與瓊膠、淀粉含量的相關(guān)性研究。Li等[30]報(bào)道了半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase,galt) 基因的克隆，galt基因的相對(duì)表達(dá)量與藻體的瓊膠含量一定程度的相關(guān)性，推測(cè)galt基因是瓊膠合成途徑中的一種重要酶。張揚(yáng)等[31]獲得UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,glup)基因的全長(zhǎng)序列，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與不同野生藻株藻體瓊膠含量很強(qiáng)的相關(guān)性。Chang等[32]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)與不同鹽度培養(yǎng)、P限制條件培養(yǎng)和四個(gè)不同栽培品系龍須菜中瓊膠含量明顯的正相關(guān)關(guān)系。他們的研究結(jié)果顯示了參與龍須菜瓊膠代謝通路同一路徑酶系反應(yīng)活性的一致性。

杜青偉[33]進(jìn)一步對(duì)3,6-內(nèi)醚-L型半乳糖合成途徑的三種酶：6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(pmi)、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)嘌呤基轉(zhuǎn)移酶(mpg)、GDP-甘露糖-3，5-表型異構(gòu)酶(gme)與淀粉合成途徑末端酶：淀粉合酶(fss)的基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)調(diào)控的研究，揭示了龍須菜瓊膠代謝途徑不同路徑的時(shí)間轉(zhuǎn)換規(guī)律，也提出了瓊膠含量的指示基因[33-34]。

他們的研究表明龍須菜中存在紅藻中普遍類型的瓊膠與淀粉代謝通路，且多個(gè)基因的表達(dá)與終產(chǎn)物-瓊膠或淀粉含量相關(guān)。

龍須菜瓊膠代謝途徑和其他江蘺中基本一致。Siow等[35]通過(guò)高通量測(cè)序獲得了張氏江蘺(Gracilariachangii)中GDP-mannose-3′,5′-epimerase (gme)基因的全長(zhǎng)序列，并證明gme基因表達(dá)量與三個(gè)江蘺物種中瓊膠含量的正相關(guān)關(guān)系。Lim等[36]進(jìn)一步報(bào)道了張氏江蘺瓊膠含量和強(qiáng)度相關(guān)性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，提出可用于快速篩選高瓊膠含量和高瓊膠強(qiáng)度株系。

對(duì)于龍須菜育種而言，瓊膠含量與強(qiáng)度是重要的產(chǎn)業(yè)相關(guān)性狀，快速、穩(wěn)定的性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和使用可以提高遺傳育種篩選的準(zhǔn)確性，同時(shí)加速育種進(jìn)程，將成為經(jīng)濟(jì)性狀篩選的重要技術(shù)手段。

2.2 誘變育種技術(shù)

基于多種分子標(biāo)記與技術(shù)：核糖體RNA及其間隔區(qū)、微衛(wèi)星DNA (SSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)及限制性位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性(RSAP)，對(duì)龍須菜種群和家系內(nèi)部、不同地理群體的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)龍須菜種群/群體個(gè)體間遺傳多樣性較低，遺傳相似系數(shù)較高的特點(diǎn)[37-40]。這一方面反映出龍須菜比較特殊的生存策略，另一方面則提示龍須菜種質(zhì)保存應(yīng)側(cè)重更廣泛的地理群體個(gè)體，而更重要的是這表明常用的選擇育種方案在龍須菜遺傳育種過(guò)程中可以發(fā)揮的作用有限，從而為龍須菜育種策略的選擇提供了指向。

對(duì)于較低遺傳多樣性的物種，誘變育種無(wú)疑是快捷方便的方式。誘變育種技術(shù)根據(jù)不同作用機(jī)理，主要分為物理誘變和化學(xué)誘變。龍須菜中常用的是化學(xué)誘變。用MNNG和EMS處理龍須菜獲得了多種色素突變體[41-42]，成為解析龍須菜藻體顏色控制的基礎(chǔ)材料，龍須菜良種“981”和“2007”的培育也經(jīng)歷了MNNG誘變處理[21, 25]。

考慮到龍須菜藻體有較厚的細(xì)胞壁，影響某些物理誘變方法的處理效果，付峰[43-44]對(duì)龍須菜缺乏厚壁的四分孢子和果孢子進(jìn)行紫外線輻照誘變，來(lái)篩選抗逆速生突變體，建立了龍須菜四分孢子和果孢子的紫外誘變技術(shù)方法，及耐高溫藻株的篩選方案；并獲得了性狀突出的株系。

魏惠惠等[45]則提供了一套采用X射線進(jìn)行誘變的龍須菜誘變篩選技術(shù)方案，獲得了耐高溫突變株和低磷速生突變株，為下一步遺傳研究和生產(chǎn)應(yīng)用提供了材料。Jiang等[46]研究確認(rèn)了低磷突變株系的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，及其可能的磷代謝調(diào)控機(jī)理。

目前已有多種誘變技術(shù)在龍須菜中進(jìn)行了成功的嘗試和應(yīng)用，提供了較為可行的技術(shù)方案，篩選的品系也具有更多類型的產(chǎn)業(yè)預(yù)期性狀。

3 產(chǎn)業(yè)發(fā)展挑戰(zhàn)與展望

龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)仍面臨著一些需要突破的問(wèn)題。在很長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)，龍須菜主要栽培品種只有幾個(gè)，且品種培育針對(duì)的性狀比較單一，因此需要根據(jù)海域水文環(huán)境特征和產(chǎn)業(yè)下游處理和加工特點(diǎn)，選育海域適應(yīng)性、多元化的海藻品種，以保證和促進(jìn)區(qū)域化、針對(duì)性生產(chǎn)的需要。同時(shí)，借助現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)龍須菜進(jìn)行遺傳育種勢(shì)在必行。建立全面穩(wěn)定的龍須菜/江蘺經(jīng)濟(jì)性狀評(píng)估技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)基于全基因組信息的聚合良種選育和重要經(jīng)濟(jì)性狀的精細(xì)定位和鑒定具有重要意義。隨著第二代與單分子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的藻類完成全基因組測(cè)序，全基因組選擇育種在藻類中的實(shí)現(xiàn)并不遙遠(yuǎn)。

基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)則使分子育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)飛躍性提升，如ZFN、TALEN等，尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)[47-48]，它具有其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，在一些微藻中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)基于該技術(shù)體系的基因編輯[49-51]，表明在藻類中該技術(shù)的可行性，雖然目前在大型海藻中還沒(méi)有成功的報(bào)道，但考慮到該技術(shù)的高效性和應(yīng)用前景，在龍須菜等大型海藻中建立這項(xiàng)突破性技術(shù)也是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

當(dāng)前，中國(guó)龍須菜栽培仍以營(yíng)養(yǎng)繁殖的方式，通過(guò)藻段夾苗進(jìn)行育苗栽培，這種方法簡(jiǎn)單易操作，無(wú)需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的培訓(xùn)即可被用于生產(chǎn)，為廣大的海藻養(yǎng)殖戶所接受。但龍須菜栽培所需苗種直接取自浮筏架上采收的藻體，長(zhǎng)期以來(lái)形成“南用北調(diào)”、“北用南調(diào)”的格局，也成為栽培成本與生產(chǎn)不可控因素之一。

鑒于營(yíng)養(yǎng)繁殖栽培方式的缺陷，積極探索龍須菜苗種繁育的新方法，建立在龍須菜有性生殖與孢子繁育的基礎(chǔ)之上的苗種制備，可有效地解決：栽培所需苗種來(lái)源；龍須菜渡夏室內(nèi)保存問(wèn)題；育苗的重復(fù)性、穩(wěn)定性與可調(diào)控性；有效降低因“南用北調(diào)”、“北用南調(diào)”所產(chǎn)生的費(fèi)用及人力、物力消耗；可大量繁育出不同遺傳背景的種苗，亦可針對(duì)不同海區(qū)育苗等[8-9]。此外，完善和推廣新的生態(tài)栽培模式，如與動(dòng)物混養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的同時(shí)，提高養(yǎng)殖效率。因此包括栽培方式在內(nèi)的設(shè)施、技術(shù)的深入探索和研發(fā)是保障產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

另外，當(dāng)前江蘺栽培仍是看天吃飯，因此充分了解龍須菜栽培產(chǎn)量、質(zhì)量的影響因素至關(guān)重要，這需要對(duì)不同栽培海區(qū)在不同栽培季節(jié)栽培狀況的持續(xù)調(diào)查觀測(cè)，以為龍須菜栽培提供指導(dǎo)性建議和應(yīng)對(duì)措施。

致謝:感謝中國(guó)海洋大學(xué)潘克厚教授和寧波大學(xué)徐年軍教授對(duì)本文提出的建設(shè)性意見(jiàn)和建議。