王文杰,余敏紅,范世珍,周新榮,于波海*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001;2.黑龍江省大慶市人民醫(yī)院;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院)

宮頸癌是全球嚴(yán)重威脅婦女健康的第四大惡性腫瘤。2012年，全世界宮頸癌新增病例約為528 000例，宮頸癌死亡人數(shù)為266 000人[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要危險(xiǎn)因素，其中99.0%的宮頸癌與HPV感染有關(guān)。目前已鑒定出100多種人乳頭瘤病毒類(lèi)型。根據(jù)其致癌能力可分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)兩類(lèi)。hrHPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82[2]。約71%的宮頸癌與HPV16和HPV18感染有關(guān)。HPV的患病率和類(lèi)型具有種族差異，在亞洲，HPV52和HPV58的感染更為常見(jiàn)[3]。hrHPV感染被認(rèn)為是宮頸癌及其前體病變的主要危險(xiǎn)因素[4]。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，參與到基因調(diào)控過(guò)程中。DNA甲基化異常是導(dǎo)致腫瘤抑制基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵機(jī)制之一。DNA甲基化變化的積累與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。PAX1隸屬于配對(duì)盒基因家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，PAX1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移等參與胚胎發(fā)育過(guò)程中重要器官的形成。性別決定區(qū)域 Y1(sexdeterming region Y-box1,SOX1)是編碼 SOX 家族轉(zhuǎn)錄因子中的一個(gè)成員，具有參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)以及決定細(xì)胞存亡的功能。研究表明，SOX1和PAX1基因基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化普遍存在于中國(guó)女性宮頸癌患者中，在宮頸癌前病變階段，該基因啟動(dòng)子甲基化是早期事件，宮頸癌組織中的甲基化顯著的高于正常組織，能夠?qū)⑦M(jìn)展為癌前病變的高危人群和正常人群加以區(qū)分，所以可作為宮頸癌早期診斷的特異性甲基化分子標(biāo)志物[5，6]。

國(guó)內(nèi)外已有研究表明SOX1和PAX1基因啟動(dòng)子甲基化有望成為新型的檢測(cè)宮頸癌的分子生物標(biāo)志物。本研究檢測(cè)SOX1和PAX1基因啟動(dòng)子甲基化在感染不同風(fēng)險(xiǎn)HPV型別的患者中檢出率，探究SOX1和PAX1基因啟動(dòng)子甲基化和不同風(fēng)險(xiǎn)HPV型別的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本采集

本研究獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。研究對(duì)象為宮頸細(xì)胞學(xué)異常和/或?qū)m頸HPV異常，需要陰道鏡進(jìn)一步檢查的患者，且無(wú)子宮切除史，孕婦以及有泌尿系統(tǒng)腫瘤或泌尿系統(tǒng)感染的患者不納入本試驗(yàn)。本次研究共收集宮頸脫落細(xì)胞樣本例數(shù)為324例。在婦科檢查室，患者在陰道鏡檢查前，醫(yī)生使用凱普公司的宮頸細(xì)胞采樣刷采集宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，并將取樣刷放入配套保存液中(粵潮械備20150018號(hào))。

1.2 標(biāo)本處理

將樣本轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，采用凱普的核酸提取或純化試劑(粵穗械備20170053號(hào))提取宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的DNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法操作。以上提取的DNA保存在-15℃以下。

1.3 HPV檢測(cè)

所有樣本的HPV檢測(cè)采用凱普37種人乳頭狀瘤病毒分型檢測(cè)試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)，共可以檢測(cè)37種HPV基因型(HPV6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84)，其中HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68為14種HPV高危型別。

1.4 亞硫酸鹽修飾法

采用凱普的核酸提取或純化試劑(粵穗械備20181080號(hào))對(duì)提取樣本DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理(模板DNA的濃度不低于200 ng)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法操作。以上亞硫酸鹽修飾后的DNA保存在-15℃以下。

1.5 甲基化特異性聚合鏈反應(yīng)

反應(yīng)體系共20 μl，主要包括：2 × PCR reaction mix(promega，M5122)10 μl；SOX1基因上、下游引物各0.5 μl；PAX1基因上、下游引物各0.5 μl；內(nèi)參基因ACTB基因上、下游引物0.5 μl；SOX1基因、PAX1基因和內(nèi)參基因ACTB的探針各0.4 μl；純水3.4 μl；DNA聚合酶0.5 μl；模板(亞硫酸氫鹽修飾 DNA)1 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；然后95℃變性20 s，60℃退火及延伸30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV型別與SOX1和PAX1基因甲基化檢出率的相關(guān)性

不同HPV型別中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率如表1所示。由結(jié)果可知，在感染最高風(fēng)險(xiǎn)致癌型別HPV16/18患者中，SOX1和PAX1基因甲基化檢出率最高為54.9%；其次是感染非16/18 hrHPV患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率為24.0%；在感染其他型別HPV患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率為11.1%；在HPV檢測(cè)陰性患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率為2.2%。

表1 感染不同HPV型別患者中SOX1和PAX1基因甲基化檢出率

2.2 HPV16/18陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

HPV16/18陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率如表2所示。由結(jié)果可知，HPV16/18陽(yáng)性的CIN3+患者的甲基化檢出率為86.0%，HPV16/18陽(yáng)性的CIN2患者的甲基化檢出率為35%，HPV16/18陽(yáng)性的病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為14.3%。

表2 HPV16/18陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

2.3 非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率如表3所示。由結(jié)果可知，非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性的CIN3+患者的甲基化檢出率為80.0%，非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性的CIN2患者的甲基化檢出率為37%，非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性的病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為5.3%。

表3 非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

2.4 其他HPV型別陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

其他HPV型別陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率如表4所示。由結(jié)果可知，CIN3+的患者中未發(fā)現(xiàn)僅感染除14種hrHPV的其他HPV型別，而其他HPV型別陽(yáng)性的CIN2患者的甲基化檢出率為33.3%，非其他HPV型別陽(yáng)性的病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為6.7%。

表4 其他HPV型別陽(yáng)性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

2.5 HPV檢測(cè)陰性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

HPV檢測(cè)陰性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率如表5所示。由結(jié)果可知，在病理正常/CIN1患者的甲基化檢出率為97.4%。存在5例CIN2的患者HPV檢測(cè)和甲基化檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，1例CIN3+的患者HPV檢測(cè)和甲基化檢測(cè)結(jié)果皆為陰性。

表5 HPV檢測(cè)陰性的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率

3 討論

高危型HPV的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要因素已得到公認(rèn)，所以以HPV為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于宮頸癌篩查。研究表明，不同hrHPV基因型別具有不同致病風(fēng)險(xiǎn)。在世界范圍內(nèi)，大約70%的宮頸癌是由于HPV16和18持續(xù)性感染導(dǎo)致的。由于大部分HPV感染是一過(guò)性感染，在12個(gè)月內(nèi)90%的HPV感染能夠通過(guò)自身機(jī)體的免疫力自動(dòng)清除，而HPV DNA檢測(cè)無(wú)法區(qū)別一過(guò)性感染和持續(xù)性感染，所以HPV DNA檢測(cè)的靈敏度較高，特異性較低。所以很多患者雖然HPV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，但并未發(fā)生有臨床意義的宮頸病變。

特異性基因甲基化檢測(cè)是一種新的癌癥篩查策略，一個(gè)最佳的生物標(biāo)志物將有助于早期發(fā)現(xiàn)癌癥。研究發(fā)現(xiàn)PAX1、SOX1、ZNF582以及POU4F3等宮頸癌特異性甲基化基因在檢測(cè)CIN3+樣本具有較好的表現(xiàn)，宿主基因甲基化檢測(cè)CIN2或CIN3的敏感性在69%-74%之間，特異性在66%-82%之間顯示了其臨床價(jià)值[3,5-7]。

在本研究中，感染不同風(fēng)險(xiǎn)HPV型別的患者的甲基化水平也是不一致的，隨HPV型別風(fēng)險(xiǎn)的增大，其甲基化水平也是增加的。在感染高危型HPV16/18的患者的甲基化水平明顯高于其他12中高危HPV型別和其他低危HPV型別；HPV16/18陽(yáng)性下SOX1和PAX1基因在病理陰性/CIN1的患者中的甲基化檢出率僅為14.3%。無(wú)論在HPV16/18陽(yáng)性、非HPV16/18 hrHPV陽(yáng)性或者其他型別HPV陽(yáng)性下的不同級(jí)別宮頸病變者的甲基化檢出率也是隨病變級(jí)別的加深而增大。DNA甲基化是抑制外來(lái)DNA和病毒基因組入侵的一種常見(jiàn)的細(xì)胞防御機(jī)制。STEENBERGEN等人研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變的主要因素，且hr-HPV還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生遺傳及表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致癌變[8]。所以在感染高風(fēng)險(xiǎn)HPV型別的患者的甲基化水平是明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)HPV型別的患者，尤其是HPV16和/或18中。按照ASCCP在2014年制定的子宮頸癌篩查中期指南，建議HPV16和/或18陽(yáng)性者可直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，而其他高危型別陽(yáng)性者需根據(jù)細(xì)胞學(xué)而定，細(xì)胞學(xué)異常者直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，無(wú)異常者則1年后隨訪。如何利用特異性的分子標(biāo)志物將高度病變的人群識(shí)別，避免低風(fēng)險(xiǎn)人群不必要的轉(zhuǎn)診導(dǎo)致過(guò)度診療，對(duì)HPV陽(yáng)性人群的分流管理是HPV檢測(cè)作為初篩要面臨的棘手問(wèn)題。將宿主基因甲基化分析與人乳頭瘤病毒基因檢測(cè)相結(jié)合似乎是宮頸癌篩查的一種新策略。宿主基因良好的特異性可以提高HPV陽(yáng)性女性宮頸異常檢測(cè)的準(zhǔn)確性。