王娜，甲芝蓮，吳強

研究報告

RFX5調(diào)控原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)

王娜，甲芝蓮，吳強

上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院比較生物醫(yī)學(xué)研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，上海 200240

基因的表達(dá)調(diào)控與基因組在細(xì)胞核內(nèi)的三維空間架構(gòu)相輔相成，原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇在大腦發(fā)育中起到關(guān)鍵作用，可以作為研究基因表達(dá)調(diào)控機制的模式基因。轉(zhuǎn)錄因子RFX5 (regulatory factor x 5)是翼螺旋家族(winged HLH family)的成員，其蛋白由寡聚化結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、螺旋結(jié)構(gòu)域和激活域組成，在調(diào)控免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復(fù)合物II類(major histocompatibility complex class II, MHC II)的表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)RFX5與CTCF在全基因組上結(jié)合的位點有部分重疊，利用CRISPR/Cas9 DNA大片段編輯技術(shù)，構(gòu)建了基因缺失的HEC-1-B細(xì)胞系。通過RNA-seq實驗，發(fā)現(xiàn)RFX5敲除能夠顯著升高、、的表達(dá)水平。通過ChIP-nexus實驗，發(fā)現(xiàn)敲除RFX5導(dǎo)致染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白基因簇處的結(jié)合增加。最后，染色質(zhì)構(gòu)象捕獲QHR-4C實驗發(fā)現(xiàn)、啟動子與遠(yuǎn)端增強子HS5-1的染色質(zhì)遠(yuǎn)距離相互作用增強。上述研究表明RFX5蛋白可能通過調(diào)控染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)影響原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)，為未來進(jìn)一步探索RFX5的功能提供了參考。

RFX5；；CTCF；cohesin；CRISPR/Cas9

人類基因組由超過30億的核苷酸所組成，長度超過2 m，而細(xì)胞核的大小僅有數(shù)微米，因此基因組經(jīng)過有規(guī)律地折疊形成復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)，最終被包含在細(xì)胞核內(nèi)[1]。然而，關(guān)于基因組如何折疊形成三維空間結(jié)構(gòu)及其對基因組功能有何影響，仍有待進(jìn)一步研究。原鈣粘蛋白(protocadherin,)基因簇是研究三維基因組空間結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式基因。人類原鈣粘蛋白基因簇位于5號染色體上，線性長度橫跨將近1 Mb，由原鈣粘蛋白、原鈣粘蛋白和原鈣粘蛋白3個基因簇組成，共包含53個基因[2~9]。原鈣粘蛋白基因簇與原鈣粘蛋白基因簇的基因排列類似，均包含可變區(qū)外顯子和恒定區(qū)外顯子，并且每一個可變區(qū)外顯子都有各自獨立的啟動子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以順式剪接到下游的3個恒定區(qū)外顯子[10]。原鈣粘蛋白基因簇則僅包含可變區(qū)外顯子，并無恒定區(qū)外顯子。原鈣粘蛋白基因簇在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能，包括中間神經(jīng)元的存活、皮層神經(jīng)元的遷移、神經(jīng)元的自我識別、突觸的形成、樹突的自我回避以及軸突的發(fā)育等[11]，因此研究原鈣粘蛋白的表達(dá)調(diào)控機制對理解大腦的正常發(fā)育以及認(rèn)識腦疾病的發(fā)生發(fā)展十分重要。

人類原鈣粘蛋白基因簇由13個隨機表達(dá)的可變區(qū)外顯子(~)，2個C型可變區(qū)外顯子(和)，以及3個恒定區(qū)外顯子構(gòu)成(圖1A)[2,6]。原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)受下游的增強子HS5-1調(diào)控[12]。在一維線性狀態(tài)下，HS5-1與所調(diào)控的原鈣粘蛋白基因的線性距離在115~250 kb之間(與最遠(yuǎn)的相距250 kb，與最近的相距115 kb)。因此，增強子HS5-1必須通過遠(yuǎn)距離染色質(zhì)環(huán)形成在空間上靠近啟動子的三維高級結(jié)構(gòu)。CTCF (CCCTC-binding factor)蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，與DNA結(jié)合具有方向性。原鈣粘蛋白到的每一個啟動子上都有兩個正向的CTCF結(jié)合位點(CTCF binding site, CBS)：CSE (conserved sequence element)和eCBS (exonic CBS)，原鈣粘蛋白的啟動子上有一個正向的CBS，但是原鈣粘蛋白的啟動子上無CBS。有趣的是，下游的增強子HS5-1上有兩個反向的CBS HS5-1a和HS5-1b (圖1A)[13~15]。CTCF蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合在這些CBS上，滑動的cohesin蛋白復(fù)合體會停留在啟動子的正向CBS和增強子的反向CBS上，從而形成染色質(zhì)環(huán)，使得增強子靠近并激活基因的表達(dá)[13,14,16]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在增強子HS5-1處有RFX5 (regulatory factor x 5)蛋白結(jié)合，并且與CTCF的結(jié)合區(qū)域相互重疊。由此推測RFX5可能通過影響三維基因組的空間構(gòu)象調(diào)控基因的表達(dá)。

RFX5是一種DNA結(jié)合蛋白[17]，屬于螺旋–轉(zhuǎn)角–螺旋家族中翼螺旋亞家族[18]。RFX5的首次報道見于對II型裸淋巴細(xì)胞綜合征(the bare lymphocyte syndrome, BLS)的研究[19]。BLS是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，該病的特征在于缺乏主要組織相容性復(fù)合物II類(major histocompatibility complex class Ⅱ, MHC II)分子的表達(dá)，從而導(dǎo)致了嚴(yán)重的免疫缺陷，機體反復(fù)遭受感染，患者常在嬰幼兒期死亡[20~25]。研究表明，MHC II類分子缺乏的根本原因是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的相關(guān)因子RFX5蛋白存在缺陷，致使MHC II類分子無法在免疫細(xì)胞中表達(dá)或表達(dá)降低[26,27]，由此開啟了轉(zhuǎn)錄因子RFX5在基因表達(dá)調(diào)控方面的研究[28~32]?；虬?1個外顯子，編碼一個含有616個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白包含4個結(jié)構(gòu)域：寡聚化結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、螺旋結(jié)構(gòu)域和激活域[33,34]。RFX5蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域由一個較長的中央螺旋和兩個較短的螺旋組成。當(dāng)RFX5單獨存在時，兩個RFX5分子的中心螺旋形成一個反平行的盤繞線圈，側(cè)翼螺旋垂直排列在長螺旋的末端，使得RFX5二聚體的形狀如釘書釘[35]。此時高度保守的DNA結(jié)合域被遮蔽，無法與染色體結(jié)合。只有在寡聚化結(jié)構(gòu)域及螺旋結(jié)構(gòu)域通過與配體RFXANK、RFXAP的相互作用形成RFX復(fù)合物，暴露出包裹在內(nèi)部的DNA結(jié)合域時，RFX5才能與啟動子、增強子等結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)控功能[33]。關(guān)于RFX5的研究主要集中在MHC II類分子的表達(dá)調(diào)控方面，以及RFX復(fù)合體如何相互作用[26,36~39]，鮮有涉及RFX5在三維基因組空間結(jié)構(gòu)形成方面的作用。

本研究利用II型成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9)系統(tǒng)發(fā)展起來的DNA大片段編輯技術(shù)[40~47]，通過引入兩個sgRNA (single-guide RNA)，將Cas9蛋白定位到靶點位置并進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，經(jīng)過細(xì)胞自我修復(fù)后，可以獲得基因片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復(fù)和插入[42,46]。本研究通過向細(xì)胞中導(dǎo)入兩個sgRNA，得到基因敲除的單細(xì)胞克隆株。然后利用RNA-seq實驗檢測敲除細(xì)胞中基因表達(dá)水平的變化，通過染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immu-noprecipitation, ChIP)實驗結(jié)合深度測序，探尋敲除RFX5對于染色質(zhì)空間架構(gòu)蛋白CTCF和cohesin蛋白復(fù)合體在DNA結(jié)合方面的影響，最后通過定量高分辨率染色體構(gòu)象捕獲(quantitative high-resolution chromosome conformation capture copy, QHR-4C)實驗探究敲除RFX5對原鈣粘蛋白基因簇啟動子與增強子之間三維空間結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)RFX5能夠抑制染色質(zhì)遠(yuǎn)距離環(huán)化，對進(jìn)一步了解RFX5蛋白的功能有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pGL3-U6-sgRNA-Puromycin-BsaI質(zhì)粒由南京大學(xué)黃行許教授提供；人源化pST374-Cas9-ZF-NLS質(zhì)粒由北京大學(xué)席建忠教授提供；人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1-B來自于美國菌種保藏中心(ATCC)；MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗、谷氨酰胺和丙酮酸鈉均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自南美ExCell公司；sgRNA、測序引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司、上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自美國AXYGEN公司；MinElute Gel Extraction kit購自德國QIAGEN公司；Lipo3000購自美國Invitrogen公司；I限制性內(nèi)切酶、NEB Buffer 2、T4 DNA連接酶、T4 DNA連接酶緩沖液、Poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module、RNA文庫制備試劑盒、末端修復(fù)酶、末端修復(fù)酶緩沖液、Klenow Fragment (3?→5? exo-)、dA-Tailing反應(yīng)緩沖液、Blunt/TA連接酶混合液、NEB Buffer 2.1、T4 DNA聚合酶、Lambda核酸外切酶、RecJf核酸外切酶、蛋白酶K、Q5?Hot Start HiFi PCR Master Mix等均購自美國NEB公司；TRIzol購自美國Ambion公司；AMPure?XP Beads購自美國Beckman Coulter公司；GreenMix、dNTPs購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Protein G beads、甲醛溶液、RNase A、糖原、Fast DigestH I限制性內(nèi)切酶均購自美國Thermo公司；CirLigase? ssDNA Ligase試劑盒購自美國Epicentre公司；Rad21抗體、CTCF抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 構(gòu)建pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒

設(shè)計合成sgRNA的寡核苷酸序列如表1所示。購買的單鏈sgRNA首先用ddH2O稀釋為終濃度20 μmol/L，接著進(jìn)行引物退火步驟，反應(yīng)體系如下(總體積為20 μL)：2 μL sgRNA-F，2 μL sgRNA-R，2 μL 10 × NEB Buffer 2，14 μL ddH2O，經(jīng)微量移液器吹打混勻后放入PCR儀中。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，緩慢降溫95℃ 20 s 351個循環(huán)(自第二個循環(huán)開始逐步降溫，每個循環(huán)降溫0.2℃)，最終產(chǎn)物4℃保存。

環(huán)形pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒通過I酶切后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的分離，切膠純化得到線性pGL3-U6-sgRNA載體。將該線性化載體與退火產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，體系如下(總體積為5 μL)：0.5 μL T4 DNA連接酶，0.5 μL T4 DNA連接酶緩沖液，0.5 μL線性pGL3-U6-sgRNA載體，0.5 μL退火產(chǎn)物，3 μL ddH2O，混勻后室溫靜置30 min；將上述反應(yīng)體系加入含感受態(tài)細(xì)胞的1.5 mL離心管中，冰上靜置30 min后放入42℃水浴鍋，熱激45 s立即拿出，冰上靜置2 min；加入500 μL LB無抗培養(yǎng)基，并置于37℃搖床中培養(yǎng)45 min，均勻地涂在含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16~17 h；挑取2~3個單菌落搖菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，并測序。

表1 引物序列

sgRNA引物中帶下劃線部分為構(gòu)建質(zhì)粒所需的粘性末端。P7-index中帶下劃線部分為index。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HEC-1-B細(xì)胞培養(yǎng)在含5% CO2濃度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為加入10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉的MEM完全培養(yǎng)基。

1.4 轉(zhuǎn)染與單細(xì)胞克隆株的篩選

將處于對數(shù)生長期的約2×105/mL的HEC-1-B細(xì)胞傳代至12孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度為70%~ 90%時轉(zhuǎn)染：先用MEM培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000，混勻后室溫靜置5 min；另取一管MEM培養(yǎng)基稀釋sgRNA質(zhì)粒、Cas9質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑P3000，并將Lipo3000加入其中，室溫孵育20 min后全部加至12孔板的培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)基換為含有2 ng/μL嘌呤霉素的MEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行藥物篩選。藥篩4 d后，更換為普通的MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞量足夠時，經(jīng)過胰酶消化后，取1/10細(xì)胞置于PCR管中，室溫11,200 r/min離心3 min，棄去上清。向PCR管中加入10 μL堿裂解液，吹打混勻后放入PCR儀中，98℃ 20 min裂解細(xì)胞釋放DNA；再加入等體積的中和液，吹打混勻于?20℃冰箱中保存待用。通過設(shè)計PCR引物鑒定上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中是否含有片段刪除，若存在，則將12孔板中剩余的細(xì)胞進(jìn)行單克隆鋪板。一周后在顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞是否為單一團狀并做標(biāo)記，兩周后對單細(xì)胞克隆株進(jìn)行基因型鑒定。

1.5 單細(xì)胞克隆株的鑒定

單細(xì)胞克隆經(jīng)胰酶消化后，取部分細(xì)胞經(jīng)上述堿裂解法進(jìn)行裂解，獲得的細(xì)胞基因組作為模板，保存至?20℃冰箱待用。以特異性引物通過PCR擴增反應(yīng)得到目的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，并回收測序從而鑒定單細(xì)胞克隆株的基因型。若出現(xiàn)雙峰的情況，則通過TA克隆進(jìn)一步鑒定。

鑒定單細(xì)胞克隆株的引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系如下(總體積為10 μL)：1 μL模板DNA，0.5 μL 10 μmol/L正向引物，0.5 μL 10 μmol/L反向引物，5 μL 2 × GreenMix，3 μL ddH2O。上述反應(yīng)體系經(jīng)微量移液器吹打混勻后放入PCR儀中。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s (退火溫度根據(jù)引物的GC含量而定)，72℃延伸1 min (延伸時間根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度改變，酶延伸速度約為1 kb/min)，35~37個循環(huán)；72℃ 2 min完全延伸，最終產(chǎn)物4℃保存。

TA克?。篜CR產(chǎn)物與T載體室溫連接30 min；連接產(chǎn)物加入含感受態(tài)細(xì)胞的1.5 mL離心管中，冰上靜置30 min；42℃熱激45 s；冰上2 min；向離心管加入500 μL LB無抗培養(yǎng)基，37℃搖床中培養(yǎng)45 min；均勻涂在含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~17 h；挑取8~10個單菌落搖菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，并送測序。

高血壓性腦出血是一種常見的腦血管疾病,其出血部位以基底節(jié)區(qū)為常見,在老年人中發(fā)病率高,出血后需及時清除血腫,避免引起血腫繼發(fā)損傷和神經(jīng)功能進(jìn)一步損害[3-4]。傳統(tǒng)的開顱手術(shù)創(chuàng)傷大,且老年患者耐受性差,容易產(chǎn)生感染等嚴(yán)重并發(fā)癥。微創(chuàng)穿刺引流術(shù)近年來得到廣泛應(yīng)用。微創(chuàng)穿刺引流術(shù)創(chuàng)傷輕,對功能區(qū)域的損害達(dá)到最小化,且對于血腫引流可分次、緩慢進(jìn)行,可以降低顱內(nèi)感染和繼發(fā)性出血的風(fēng)險,幫助患者手術(shù)后更快恢復(fù)神經(jīng)功能,提高生活質(zhì)量[5-6]。

1.6 單細(xì)胞克隆株總RNA的提取

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞傳代至12孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度為80%~90%時收集細(xì)胞提取RNA：丟棄原孔中的培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2~3次并棄去上清；加入500 μL/孔TRIzol溶液，室溫靜置15 min；吹打混勻后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中；加入100 μL三氯甲烷，震蕩儀劇烈震蕩15 s，室溫孵育2~3 min；放入4℃離心機中12,000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清(約200 μL左右)至新的1.5 mL離心管中；加入250 μL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫孵育10 min；放入4℃離心機中12,000 r/min離心10 min，棄去上清；加入500 μL 75%乙醇，上下顛倒10次混勻，放入4℃離心機中12,000 r/min離心5 min，棄去上清(勿動沉淀)；短暫離心以除去管壁上殘留的液滴，室溫開蓋干燥10 min；加入20 μL無核酸酶的水溶解沉淀，震蕩混勻，用NanoDrop2000測濃度后于?80℃冰箱保存。

1.7 RNA-seq建庫和高通量測序

單細(xì)胞克隆株總RNA抽提后，使用Poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module試劑盒提取成熟的mRNA，合成并純化獲得cDNA；使用RNA文庫制備試劑盒經(jīng)過末端修復(fù)、加接頭、PCR擴增、純化等步驟構(gòu)建文庫，經(jīng)Qubit3 Fluorometer測量濃度后于?20℃冰箱保存，以備高通量測序。文庫經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序，利用特異性index序列對測序結(jié)果進(jìn)行拆分，通過Cufflinks、STAR等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[48]。所用P7-index序列見表1。

1.8 RFX5與CTCF蛋白結(jié)合位點分析

ChIP-seq數(shù)據(jù)來自GEO，所分析的細(xì)胞系為人宮頸癌細(xì)胞系HeLa-S3，RFX5蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)編號為GSM935560，CTCF蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)編號為GSM749739。利用Bedtools分析結(jié)合峰，并畫出韋恩圖。啟動子處RFX5和CTCF蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)來自人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH，數(shù)據(jù)編號分別為GSM1003629和GSM1003633。

1.9 單細(xì)胞克隆株ChIP-nexus建庫與高通量測序

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞系傳代至10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度為80%~90%時收集細(xì)胞：丟棄原10 cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1 × PBS清洗1次并棄去上清；加入1 mL/皿胰酶溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2~3 min；加入1 mL新鮮的MEM培養(yǎng)基終止胰酶消化，吹打混勻后轉(zhuǎn)至15 mL離心管中；放入離心機中室溫2000 r/min離心5 min，棄去上清(勿動下層細(xì)胞沉淀)；加入10 mL培養(yǎng)基重懸沉淀；加入670 μL 16%多聚甲醛溶液，置于旋轉(zhuǎn)儀中，室溫顛倒混勻10 min；加入712.5 μL 2 mol/L的甘氨酸溶液，置于旋轉(zhuǎn)儀中，室溫顛倒混勻5 min；放入4℃離心機中3300 r/min離心10 min，棄去上清；用預(yù)冷的1×PBS重懸細(xì)胞沉淀，放入4℃離心機中3300 r/min離心5 min，棄去上清；短暫離心以除去管壁上的殘留液，用微量移液器吸取上清并丟棄；立即用液氮速凍后放入?80℃冰箱保存待用或直接進(jìn)行裂解超聲。

超聲后，放入4℃離心機中以最大轉(zhuǎn)速離心10 min；轉(zhuǎn)移上清至新的無菌1.5 mL離心管中，加入適量抗體，置于4℃冰箱旋轉(zhuǎn)儀中緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜；加入適量Protein G beads孵育；接著進(jìn)行末端修復(fù)、3?末端添加一個腺嘌呤脫氧核苷酸、連接接頭、接頭填補和修剪、Lambda和RecJf核酸外切酶的酶切反應(yīng)、DNA洗脫與純化、單鏈環(huán)化等步驟構(gòu)建文庫[49]，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。用Qubit3 Fluorometer測濃度后于?20℃冰箱保存，以備高通量測序。文庫經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序，根據(jù)index序列對測序結(jié)果進(jìn)行拆分，通過Bowtie2比對到GRCh37/hg19基因組，用BamCoverage進(jìn)行歸一化處理，標(biāo)準(zhǔn)化到RPKM (reads per kilobase per million mapped reads)。所用P7-index序列見表1。

1.10 單細(xì)胞克隆株QHR-4C建庫與高通量測序

將生長旺盛的細(xì)胞系傳代至10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度為80%~90%時收集細(xì)胞。接著進(jìn)行酶切、連接、DNA純化、超聲、線性PCR擴增、加接頭、PCR擴增、純化等步驟構(gòu)建文庫[15,50]。用Qubit3 Fluorometer測量濃度后置于?20℃冰箱保存，以備高通量測序。文庫經(jīng)蘇州金唯智生物科技有限公司的Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序，根據(jù)index序列對測序結(jié)果進(jìn)行拆分，去除重復(fù)的Reads，通過Bowtie2比對到GRCh37/hg19基因組，用Samtools將比對文件進(jìn)行轉(zhuǎn)換，隨即用R3Cseq計算每個II酶切片段的Reads數(shù)，將總Reads標(biāo)準(zhǔn)化到一百萬，最后根據(jù)冪律分布對觀測點附近進(jìn)行反向累積擬合得到染色質(zhì)互作圖。由于超聲產(chǎn)生DNA末端的隨機性，將RFX5敲除細(xì)胞與野生型細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行相減得到差異性數(shù)據(jù)[15,50]。所用P7-index序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 使用CRISPR/Cas9大片段編輯技術(shù)建立RFX5基因敲除的單細(xì)胞克隆株

圖1 使用CRISPR/Cas9技術(shù)建立RFX5基因敲除的單細(xì)胞克隆株

A：人類原鈣粘蛋白()基因簇示意圖。人類原鈣粘蛋白基因簇包含15個可變區(qū)外顯子(13個隨機表達(dá)型及2個C型)和3個恒定區(qū)外顯子。每1個隨機表達(dá)型外顯子的啟動子上都有2個正向的CTCF結(jié)合位點(CBS)，C型外顯子的啟動子上有1個正向的CBS，而的啟動子上沒有CBS。原鈣粘蛋白基因簇下游的增強子HS5-1上含有兩個反向的CBS。在CTCF和cohesin蛋白復(fù)合體的作用下，HS5-1增強子與原鈣粘蛋白基因啟動子之間(除外)形成染色質(zhì)環(huán)調(diào)控這些基因的表達(dá)。B：敲除基因所使用的一對sgRNA (sgRNA1和sgRNA2)以及各鑒定引物的位置示意圖。C：分析比較HeLa-S3細(xì)胞中RFX5蛋白和CTCF蛋白結(jié)合峰的重疊情況。D：RFX5在啟動子和HS5-1增強子中分別有兩個結(jié)合峰，并且部分與CTCF結(jié)合峰有重疊。E：基因敲除的單細(xì)胞克隆株K30和K56的基因型鑒定結(jié)果。以野生型細(xì)胞(WT)作為對照；用F1/R2或F2/R3引物，在sgRNA切點處，WT可擴增出884 bp或1587 bp片段，K30和K56中未檢測到以上2個片段；用引物F1/R1，在K30和K56中擴增出785 bp的條帶，而WT無條帶。F：F1/R1引物在K30和K56單細(xì)胞克隆株中擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果圖。

設(shè)計兩個sgRNA (sgRNA1和sgRNA2)，分別定位在啟動子下游101 bp和終止密碼子處(PAM上游3 bp)，二者相距4034 bp (圖1B)。利用這兩個sgRNA與Cas9切割基因，能造成基因絕大部分編碼序列的刪除。在切口位置上下游設(shè)計引物，檢測編輯后細(xì)胞的基因型。引物F1設(shè)計在sgRNA1切口上游645 bp，引物R1設(shè)計在sgRNA2切口下游140 bp。使用F1和R1鑒定片段刪除的單細(xì)胞克隆株，經(jīng)過PCR反應(yīng)可獲得長度為785 bp的產(chǎn)物，而野生型細(xì)胞無條帶(圖1E)。為排除雜合子，對有片段刪除的單細(xì)胞克隆株進(jìn)一步在sgRNA切口上下游進(jìn)行PCR擴增鑒定。對于sgRNA1切口設(shè)計引物R2，位于切口下游239 bp。sgRNA1切口處使用引物F1和R2進(jìn)行PCR，野生型或雜合子可獲得片段長度為884 bp的產(chǎn)物，而純合子敲除無條帶(圖1E)。sgRNA2切口處設(shè)計引物F2，位于sgRNA2上游779 bp，引物R3設(shè)計在sgRNA2下游808 bp (圖1B)。使用引物F2和R3進(jìn)行PCR，野生型或雜合子可獲得片段長度為1587 bp的產(chǎn)物，而純合子敲除無條帶(圖1E)。經(jīng)過上述PCR鑒定，從56個單細(xì)胞克隆株篩選到兩個敲除純合子單細(xì)胞克隆株：K30和K56。PCR產(chǎn)物測序顯示K30存在兩種不同的染色體基因型，一種為Cas9精確地切割在PAM上游3 bp處后的連接產(chǎn)物，另一種加入一個T堿基，可能為Cas9切割在sgRNA2非互補鏈PAM上游4 bp處所致。K56只存在一種基因型，即Cas9精確地切割在PAM上游3 bp處后的連接產(chǎn)物(圖1F)。

2.2 敲除RFX5基因?qū)υ}粘蛋白α基因簇表達(dá)的影響

為了研究RFX5敲除對基因表達(dá)產(chǎn)生的影響，對獲得的兩個單細(xì)胞克隆株分別進(jìn)行RNA-seq實驗。首先分析基因的表達(dá)，結(jié)果顯示兩個克隆中均檢測不到的成熟mRNA，進(jìn)一步證明了單細(xì)胞克隆株K30和K56已成功敲除基因(圖2，A和B)。進(jìn)一步分析了基因敲除對原鈣粘蛋白基因簇轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RFX5敲除的K30和K56單細(xì)胞克隆株中，相比于野生型細(xì)胞，原鈣粘蛋白基因簇基因總體轉(zhuǎn)錄水平升高(圖2C)。野生型細(xì)胞主要表達(dá)、、以及，其他基因不表達(dá)。在RFX5敲除的K30單細(xì)胞克隆株中，相比于野生型細(xì)胞，表達(dá)基因的個數(shù)沒有變化，但表達(dá)水平升高，其中表達(dá)升高1.55倍，表達(dá)升高1.34倍，表達(dá)升高1.77倍(圖2D)。在K56單細(xì)胞克隆株中，與K30單細(xì)胞克隆株一致，上述3個基因表達(dá)均升高，其中表達(dá)升高1.56倍，表達(dá)升高1.86倍，表達(dá)升高1.9倍(圖2E)。這些結(jié)果表明，基因敲除顯著提高了原鈣粘蛋白基因簇的基因轉(zhuǎn)錄水平。

2.3 敲除RFX5基因增加CTCF和cohesin蛋白在原鈣粘蛋白α基因簇的結(jié)合

為了探尋基因如何調(diào)控原鈣粘蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄，首先對CTCF蛋白在原鈣粘蛋白基因簇的結(jié)合情況進(jìn)行研究。CTCF蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，包含11個鋅指結(jié)構(gòu)域，可方向性地與DNA結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)[51]。此外，CTCF可作為絕緣子，與cohesin蛋白復(fù)合體相互作用，協(xié)同決定染色質(zhì)環(huán)形成的方向性[13,14,52,53]。采用ChIP-nexus實驗，發(fā)現(xiàn)在基因敲除的兩個單細(xì)胞克隆株K30和K56中，CTCF在轉(zhuǎn)錄升高的和基因啟動子上的結(jié)合均高于野生型克隆，在增強子HS5-1處的結(jié)合也同時升高(圖3A)。在不表達(dá)的和基因啟動子處，CTCF的結(jié)合水平也高于野生型?？傮w而言，基因的敲除顯著提高了CTCF蛋白在原鈣粘蛋白基因簇位點的結(jié)合。

結(jié)合在正向–反向CBS上的一對CTCF蛋白能夠阻斷cohesin蛋白復(fù)合體在DNA上的滑動，從而形成染色質(zhì)環(huán)。因此，絕大多數(shù)CBS上都有cohesin蛋白復(fù)合體的結(jié)合[13,14,54,55]。為了研究RFX5的敲除是否影響cohesin蛋白復(fù)合體的結(jié)合，對cohesin蛋白復(fù)合體亞基RAD21也進(jìn)行了ChIP-nexus實驗。類似于CTCF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAD21在、、、以及HS5-1處的結(jié)合也高于野生型克隆(圖3B)。

2.4 RFX5影響原鈣粘蛋白α基因簇的三維空間構(gòu)象

基于RFX5對CTCF和cohesin復(fù)合體在原鈣粘蛋白基因簇位點結(jié)合水平的影響，推測RFX5可能通過影響染色質(zhì)三維空間構(gòu)象從而調(diào)控原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)，因此對原鈣粘蛋白基因簇進(jìn)行可定量的高分辨率染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(QHR-4C)實驗。該實驗?zāi)軌蜓芯磕硞€觀測點(viewpoint, VP)與全基因組其他位點之間的空間關(guān)系[15]。本研究首先以增強子HS5-1為觀測點，發(fā)現(xiàn)在野生型細(xì)胞中，HS5-1與以及之間形成遠(yuǎn)距離的染色質(zhì)環(huán)(圖4A)。在RFX5敲除的兩個單細(xì)胞克隆株K30和K56中，HS5-1與這些基因之間的遠(yuǎn)距離相互作用增加(圖4A)。為了進(jìn)一步確定這些基因組位點間空間結(jié)構(gòu)的變化，選取啟動子為觀測點，發(fā)現(xiàn)在基因敲除的兩個單細(xì)胞克隆株中，與增強子HS5-1之間的遠(yuǎn)距離相互作用也同樣增加(圖4B)。這些結(jié)果說明，敲除基因后，原鈣粘蛋白基因簇啟動子與遠(yuǎn)端增強子HS5-1之間的染色質(zhì)相互作用增強，這可能是基因表達(dá)上調(diào)的原因。

圖2 RFX5基因敲除對原鈣粘蛋白α基因簇轉(zhuǎn)錄水平的影響

A：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT、K30、K56單細(xì)胞克隆株中基因外顯子轉(zhuǎn)錄水平。B：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT、K30、K56單細(xì)胞克隆株中基因轉(zhuǎn)錄水平。C：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT、K30、K56單細(xì)胞克隆株中原鈣粘蛋白基因簇基因總體轉(zhuǎn)錄水平。D：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT和K30細(xì)胞中原鈣粘蛋白基因簇各基因轉(zhuǎn)錄水平。E：RNA-seq數(shù)據(jù)分析比較WT和K56細(xì)胞中原鈣粘蛋白基因簇各基因轉(zhuǎn)錄水平。***：< 0.001；****：< 0.0001；FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped reads；RPM：reads of transcript per million mapped reads。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)敲除基因?qū)е略}粘蛋白基因簇表達(dá)升高，并且RFX5會阻礙CTCF蛋白和cohesin蛋白復(fù)合體在原鈣粘蛋白基因簇的結(jié)合。此外，RFX5參與調(diào)控染色質(zhì)環(huán)的形成，進(jìn)而影響染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)。

3 討論

基因組空間構(gòu)象的變化在很大程度上影響基因的表達(dá)，因此對基因組空間構(gòu)象調(diào)控機制的研究具有重要意義。CTCF通過與DNA的結(jié)合，阻礙cohesin蛋白復(fù)合體的滑動從而使DNA成環(huán)，造成遠(yuǎn)距離的啟動子、增強子彼此靠近，以此調(diào)控基因的表達(dá)[16,54]。以原鈣粘蛋白基因簇為例，基因簇下游的增強子與上游基因啟動子之間形成遠(yuǎn)距離染色質(zhì)環(huán)，調(diào)控上游基因的表達(dá)[12,56]。本研究主要集中在RFX5蛋白對原鈣粘蛋白基因簇的表達(dá)調(diào)控，以及探索其對于原鈣粘蛋白基因簇三維空間結(jié)構(gòu)的影響。

圖3 RFX5敲除促進(jìn)CTCF和RAD21在原鈣粘蛋白α基因簇位點的結(jié)合

A：ChIP-nexus數(shù)據(jù)分析比較WT、K30和K56單細(xì)胞克隆株中，CTCF蛋白在原鈣粘蛋白基因簇的結(jié)合情況。B：ChIP-nexus數(shù)據(jù)分析比較WT、K30和K56單細(xì)胞克隆株中，cohesin蛋白復(fù)合體亞基RAD21蛋白在原鈣粘蛋白基因簇的結(jié)合情況。對每個克隆分別進(jìn)行了兩次獨立的重復(fù)實驗(rep)。

圖4 RFX5敲除增加原鈣粘蛋白α基因簇增強子與啟動子的遠(yuǎn)距離空間互作

A：RFX5敲除導(dǎo)致增強子與啟動子間相互作用增加。在染色質(zhì)構(gòu)象捕獲QHR-4C實驗中，以HS5-1為觀測點(viewpoint, VP)，顯示K30和K56單細(xì)胞克隆株中增強子HS5-1與原鈣粘蛋白基因簇啟動子之間的染色質(zhì)相互作用。K30和K56分別與WT相減(K30-WT, K56-WT)發(fā)現(xiàn)RFX5敲除后HS5-1與啟動子之間的染色質(zhì)相互作用高于WT克隆。B：RFX5敲除導(dǎo)致啟動子與增強子間相互作用增加。以為觀測點的染色質(zhì)構(gòu)象捕獲實驗，顯示K30和K56單細(xì)胞克隆株中啟動子與增強子HS5-1之間的染色質(zhì)相互作用。K30和K56分別與WT相減(K30-WT, K56-WT)發(fā)現(xiàn)RFX5敲除后啟動子與HS5-1之間的染色質(zhì)相互作用高于WT克隆。

本研究使用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過導(dǎo)入兩個sgRNA，將Cas9蛋白定位在目的片段處進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞修復(fù)機制得到基因敲除的單細(xì)胞克隆株K30和K56。K30的兩條染色體有一個堿基不同，而K56兩條染色體基因型相同。本研究對這兩個單細(xì)胞克隆株的RNA-seq、ChIP-nexus、以及染色質(zhì)構(gòu)象捕獲實驗發(fā)現(xiàn)，RFX5敲除后，、、轉(zhuǎn)錄升高。推測這些轉(zhuǎn)錄水平變化是由于RFX5敲除后，蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白基因簇的結(jié)合升高，使得增強子與啟動子之間的染色質(zhì)相互作用增加而導(dǎo)致的(圖5)。該現(xiàn)象表明RFX5蛋白通過抑制CTCF和cohesin與DNA的結(jié)合調(diào)控染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，從而參與原鈣粘蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖5)。然而進(jìn)一步分析RFX5敲除后基因組范圍的轉(zhuǎn)錄變化時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平降低的基因數(shù)量多于轉(zhuǎn)錄水平升高的基因，說明RFX5蛋白在不同的基因位點可能扮演的角色不同。

圖5 RFX5蛋白調(diào)控原鈣粘蛋白α基因簇表達(dá)的模式圖

A：野生型細(xì)胞(WT)中原鈣粘蛋白基因簇基因調(diào)控示意圖。在野生型細(xì)胞中，RFX5、CTCF蛋白和cohesin復(fù)合體結(jié)合在原鈣粘蛋白基因簇啟動子和增強子上，通過CTCF/cohesin介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)，增強子調(diào)控啟動子的活性。B：RFX5敲除細(xì)胞(KO)中原鈣粘蛋白基因簇基因調(diào)控示意圖。敲除基因后，CTCF蛋白和cohesin復(fù)合體在啟動子、增強子的結(jié)合增加，使得增強子與啟動子之間的染色質(zhì)環(huán)增多，啟動子的活性增加。

通過ChIP-nexus和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲QHR-4C實驗，發(fā)現(xiàn)敲除基因后，原鈣粘蛋白基因簇中啟動子以及增強子HS5-1處的CTCF和cohesin的結(jié)合水平升高。在RFX5敲除的單細(xì)胞克隆株中，和啟動子處的CTCF/cohesin結(jié)合增加，以及這兩個啟動子與增強子HS5-1之間的染色質(zhì)相互作用增加，這些均能解釋和這兩個基因轉(zhuǎn)錄水平升高的現(xiàn)象。但是，RFX5的敲除如何上調(diào)的轉(zhuǎn)錄水平仍是未解決的問題。是原鈣粘蛋白基因簇的特殊一員，它的啟動子上沒有CTCF蛋白的結(jié)合，并且它的轉(zhuǎn)錄不受增強子HS5-1的調(diào)控，而是由另外一個增強子HS7調(diào)控[12,57,58]。本研究在的啟動子上沒有發(fā)現(xiàn)RFX5的結(jié)合，但在增強子HS7上發(fā)現(xiàn)有RFX5的強結(jié)合，說明RFX5可能通過結(jié)合增強子HS7調(diào)控的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RFX5蛋白參與調(diào)控原鈣粘蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄，敲除RFX5導(dǎo)致該基因簇的轉(zhuǎn)錄水平升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RFX5抑制染色質(zhì)環(huán)的形成，在三維基因組空間構(gòu)象中發(fā)揮作用。本研究工作將為后續(xù)對RFX5蛋白更深層次的研究提供參考。

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RFX5 regulates gene expression of thecluster

Na Wang, Zhilian Jia, Qiang Wu

Gene expression and three-dimensional (3D) genome organization are thought to be closely related. The protocadherin () clusters are central for neuronal self-avoidance in brain development and have been used as model genes to explore the role of 3D genome structures in gene regulation. Transcription factor RFX5 (regulatory factor x 5) is a member of the winged-helix subfamily of the helix-turn-helix superfamily proteins. The RFX5 protein contains four domains: oligomerization, DNA-binding, helical, and transactivation domains. RFX5 plays an important role in regulating expression of the major histocompatibility complex class II (MHC II) gene complex. Here we report a role of RFX5 in the regulation of clusteredgenes. We first knocked out thegene by using CRISPR/Cas9 DNA-fragment editing in HEC-1-B cell line. By RNA-seq experiments, we found that RFX5 deletion results in a significant increase of expression levels of the,andgenes. By ChIP-nexus experiments, we found that RFX5 deletion leads to the increased binding of CTCF and RAD21 in thecluster. Finally, through quantitative high-resolution chromosome conformation capture copy (QHR-4C) experiments, we found that RFX5 deletion results in a significant increase of long-distance chromatin interactions between the HS5-1 enhancer and its target promoters in thecluster. In conclusion, RFX5 regulates gene expression of thecluster through higher-order chromatin structure.

RFX5;; CTCF; cohesin; CRISPR/Cas9

2020-06-19;

2020-07-08

國家自然科學(xué)基金項目(編號：91640118, 31630039)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 91640118, 31630039)]

王娜，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物學(xué)。E-mail: 1191593019@qq.com

吳強，博士，教授，研究方向：三維基因組架構(gòu)與功能。E-mail: qwu123@gmail.com

10.16288/j.yczz.20-184

2020/8/6 9:31:05

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200804.1501.001.html

(責(zé)任編委: 方向東)