袁亮

（商丘職業(yè)技術學院，商丘 476000）

碳在自然界的存在形式很多，最重要的存在形式是碳酸鹽和CO2，它們在全球碳循環(huán)中具有重要作用，碳酸鹽沉積更是在全球碳循環(huán)和地質形成與演化過程中的起著決定性的作用［1］。其中碳酸鈣在海水或湖水中由于局部過飽和而導致的沉淀是地球表面重要的化學過程之一，這一過程最終導致大量的碳酸鹽巖的形成。盡管傳統(tǒng)觀點將碳酸鹽礦物的形成歸功于無機過程，但越來越多的證據表明，微生物在其形成過程中起到了極為重要的作用。然而對于微生物誘導碳酸鹽沉積的機理尚無統(tǒng)一的認識，因此研究碳酸酐酶的礦化誘導機理對于闡明全球碳循環(huán)等科學問題具有重要的意義［2］。

目前大部分文獻報道的誘導碳酸鈣沉積的微生物是一種能產生碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）的細菌［3-5］。1933年，Meldrum和Roughton［6］在牛的血紅細胞中首次發(fā)現(xiàn)了碳酸酐酶，后來在植物、藻類及微生物中也相繼發(fā)現(xiàn)了CA的存在。碳酸酐酶是一種含Zn2+的金屬酶［7］，在CO2和HCO3-相互轉化的可逆反應中起催化作用。然而盡管催化同一化學反應，但其在不同有機體中所起的生理作用存在較大差異，可以涉及離子交換、呼吸作用、pH穩(wěn)定性、CO2濃縮機制及光合作用的各個方面［8-10］。有實驗結果表明，牛的血紅細胞［11］、杜氏藻［12］和細菌［13-19］分泌的CA均可以促進碳酸鈣的結晶。因此，CA被認為是促進碳酸鹽礦化的關鍵酶之一。在CA誘導礦化的過程中，CA的活性會受到各種因素的影響，如溫度、pH值和Ca2+濃度等。因此，研究不同因素對CA活性的影響，為進一步弄清楚CA誘導CaCO3的礦化機理具有重要的意義，近幾年來，激起了科研工作者的研究興趣。

本研究利用菌種庫中一種產生胞外碳酸酐酶的CA菌進行一系列實驗，通過測試不同反應溫度、pH值和Ca2+濃度下的CA活性，研究了不同條件對CA誘導CaCO3的影響，探索出CA加速CO2水合反應的催化機理，旨在為探索CA潛在的應用價值提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

CA菌，購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；蔗糖、酵母浸粉、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈣（CaCl2），上海凌峰化學試劑有限公司；乙酸對硝基苯酯、二乙基丙二酸，國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純；蒸餾水，實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 微生物的培養(yǎng) 所選育的CA菌，細胞呈粗長桿狀，直徑1.5-2.2 μm，長4.0-6.4 μm。培養(yǎng)基選用蔗糖和酵母浸粉培養(yǎng)基，其具體成分如下：蔗糖6.0 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)培養(yǎng)液pH值為7.0，培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，在12l℃高壓滅菌器中滅菌30 min，無菌接種（1% V/V）的菌液于指定溫度、120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

1.2.2 微生物細菌數量的測試 恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后取其上層菌液進行OD400測試，OD400為菌液于波長400 nm下的光密度，OD400是采用多功能酶標儀進行測試的結果，其值越大表示細菌數量越多。

1.2.3 微生物生長及礦化過程中pH值的測定 微生物生長及礦化過程中的pH值測定采用PHS-3C（A）型精密酸度計，精度為0.1。

1.2.4 不同培養(yǎng)溫度對微生物生長和碳酸酐酶活性的影響 6.0 g/L蔗糖和1.0 g/L酵母浸粉的培養(yǎng)基（pH7.0）經高壓滅菌25 min，無菌接種（1% V/V）的菌液于5、10、15、20、25、30和35℃的溫度，120 r/min的轉速下，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，用多功能酶標儀測不同溫度下的OD400值，用顯色法測試CA菌碳酸酐酶的活性。

1.2.5 不同初始pH值對微生物生長和碳酸酐酶活性的影響 用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，無菌接種（1%V/V）菌液后，在25℃、120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，在剛開始的24 h內每隔4 h測試培養(yǎng)基溶液中的pH值變化、OD400值和碳酸酐酶的活性，后12 h每隔6 h測試培養(yǎng)基溶液中的pH值變化、OD400值和碳酸酐酶的活性。

1.2.6 不同Ca2+濃度對微生物生長和碳酸酐酶活性的影響 采用CaCl2作為鈣源，設置Ca2+濃度為（mmol/L）0、25、50、75、100、125、150、200和250，無菌接種（1% V/V）菌液后，在25℃、120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，測試培養(yǎng)基中上清液的Ca2+濃度、OD400值和碳酸酐酶的活性。其中，Ca2+濃度采用EDTA滴定法滴定。

1.2.7 碳酸酐酶活性的測試 酶活性是指酶催化某一化學反應的能力，酶活性的大小可通過單位時間內催化的某一化學反應的反應物消耗量或產物生成量來表示，可通過比色法來測定［14，20］。碳酸酐酶能夠特定催化乙酸對硝基苯酯和二乙基丙二酸的混合液反應，生成對硝基苯酚顯色，不同程度的顯色可由溶液OD460值表示，根據溶液OD460值可計算出對硝基苯酚生成量，不同活性酶催化效率不同，根據生成的對硝基苯酚量可間接反映酶活性。故要先繪制對硝基苯酚溶液濃度與OD460值關系的標準曲線。

1.2.7.1 標準曲線的繪制 分別配制出不同濃度的對硝基苯酚標準溶液，在波長460 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，并得出直線方程，結果如圖1所示。

圖1 對硝基苯酚濃度與吸光度的關系

1.2.7.2 工作液的制備 將0. 001 8 g乙酸對硝基苯酯pNPA溶于0.5 mL 無水乙醇中，另將0. 015 6 g二乙基丙二酸用9.5 mL磷酸緩沖溶液溶解，兩者混合作為工作液。

1.2.7.3 碳酸酐酶活性的測定 將微生物菌液稀釋5倍，采用移液槍移取1 mL微生物菌液和1 mL 工作溶液，混合后放入全波長酶標儀檢測箱中，設置檢測箱溫度為25℃；反應30 min 后，在波長460 nm處測量溶液的吸光度，對照對硝基苯酚濃度與吸光度的關系曲線獲得生成對硝基苯酚的量，通過單位時間對硝基苯酚生成量來表征碳酸酐酶的酶活性。酶活性的單位以U來表示。

1.2.8 微生物誘導CaCO3沉積 向250 mL的培養(yǎng)基中加入60 mmol/L的CaCl2，在25℃、120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，礦化培養(yǎng)基的成分為1.5 g蔗糖、0.25 g酵母浸粉。用1 mol/L的NaOH調節(jié)培養(yǎng)基體系的初始pH值為6.5、、7.5、8.5和9.5，每隔一段時間取出上清液，測試其反應液中的pH值和Ca2+濃度的變化。

1.2.9 微生物礦化產物表征 對所得的沉淀洗滌干燥后，利用X-射線衍射儀（XRD，Dmax-B型，日本理學公司）測定其礦物成分。測定條件：Cu靶，Kα，管壓35 kV，管流20 mA，2°/min，步長0.01°，測定范圍20°-60°。利用帶有元素分析的Sirion場發(fā)射掃描式電子顯微鏡（S-3400）觀察沉淀物的形貌并測定其元素組成。

2 結果

2.1 不同溫度下CA菌的生長和酶活性的變化

圖2是不同溫度對CA菌生長和酶活性的影響。從圖中可以看出，從低溫到高溫，隨著溫度的升高，CA菌的生長繁殖情況和酶活性存在顯著差異。在低溫下（5℃），CA菌幾乎不生長，酶活性也沒有，隨著培養(yǎng)溫度的升高，細菌的生長速度加快，酶活性也得到了相應的提高，在培養(yǎng)溫度達到25℃時，CA菌的OD400值和酶活性都達到了最大值，表明25℃是CA菌的最佳培養(yǎng)溫度。隨著培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，CA菌的生長受到抑制，酶活性也急劇下降，尤其是在35℃的培養(yǎng)溫度下，CA菌的生長情況和酶活性大大降低。由此可知，溫度是影響CA菌生長和酶活性的重要因素。

圖2 溫度對CA菌生長和酶活性的影響

2.2 不同初始pH值下CA菌生長和酶活性的變化

隨著培養(yǎng)時間的增加，初始pH值為7.0-8.5時培養(yǎng)基體系溶液的pH值先降低后上升，而當初始pH值為9.0和9.5時，溶液的pH值緩慢下降，其結果如圖3所示。不同初始pH值下的CA菌的生長和酶活性變化如圖4所示，在初始pH為7.0-8.5的范圍內，細菌生長繁殖良好，而當pH值升高到9.0以上時，細菌的生長受到嚴重抑制，當初始pH值高達9.5時，細菌生長大大降低。同時在高pH值下細菌的酶活性也受到嚴重影響，在初始pH值為7.0-8.5時，細菌的酶活性相差不大，而當初始pH值為9.0時，酶活性下降26%，隨著pH值的升高，CA酶活性急劇下降。由此可見，初始pH值能夠限制CA菌的生長和酶活性，其最佳的初始pH值為范圍7.0-8.5。

圖3 不同初始pH值下培養(yǎng)基溶液的pH值隨培養(yǎng)時間的變化

圖4 不同初始pH值對CA菌生長和酶活性的影響

2.3 不同外加Ca2+濃度下CA菌生長和酶活性的變化

離子濃度會影響微生物細胞周圍的滲透壓，進而影響微生物的生長情況。不同Ca2+濃度對細菌的生長繁殖和酶活性的影響如圖5所示，從圖中可以看出，在Ca2+濃度為0-50 mmol/L的范圍時，CA菌的OD400值和酶活性相差不大，在Ca2+濃度為50 mmol/L時，細菌的生長情況最好，酶活性也達到最大值。隨著Ca2+濃度的增加，CA菌的生長受到抑制，酶活性也逐漸降低，當Ca2+濃度達到150 mmol/L以上時，細菌幾乎不生長，酶活性幾乎沒有。由此可知，當外加Ca2+濃度在0-50 mmol/L時，細菌的生長情況良好，并且此時的碳酸酐酶活性也較好。

圖5 不同Ca2+濃度對CA菌生長和酶活性的影響

2.4 CA菌誘導CaCO3的礦化過程

培養(yǎng)液中的pH值在細菌礦化過程中起著重要的作用，在初始pH值為7.5、8.5和9.5的培養(yǎng)基中，加入50 mmol/L的CaCl2溶液，每隔6 h測試溶液中的pH值和Ca2+濃度的變化。圖6是不同初始pH值下培養(yǎng)液中的pH值隨時間的變化，從圖中可以看出，在培養(yǎng)過程中，初始pH值為7.5和8.5的培養(yǎng)液中的pH值總是先降低后升高，這主要是因為培養(yǎng)后期，營養(yǎng)物質消耗完畢，有害代謝產物的積累，造成細菌死亡，細胞自溶，從而導致pH值的升高。而初始pH值為9.5的培養(yǎng)液中的pH值緩慢下降，可能是細菌在高的pH值下無法進行正常生長，溶液pH值下降是大氣中的CO2溶解在培養(yǎng)液中所致。圖7是培養(yǎng)液中的Ca2+濃度隨培養(yǎng)時間的變化，從圖中可以看出，Ca2+濃度總是先降低后維持不變，其中培養(yǎng)液初始pH為8.5時，Ca2+濃度下降最快，而后由于細菌的溶解死亡，Ca2+的消耗與溶出達到平衡。Ca2+濃度變化最小的是培養(yǎng)液初始pH值為9.5，此時Ca2+僅僅減少了8 mmol/L，這主要是因為在較低的pH值下，CO2溶于水產生多余的H+會溶解生成的CaCO3，此時CaCO3的生成與溶解達到平衡，故而其Ca2+濃度變化較小。當培養(yǎng)液中的初始pH達到9.5時，此環(huán)境下影響了細菌的生長，導致了酶活性的降低，CO2的水合反應受到抑制，故而Ca2+的濃度變化較小。將培養(yǎng)液中的沉淀過濾、洗滌、干燥后，所得CaCO3的質量如圖8所示，從圖中可以看出，當培養(yǎng)液初始pH值為8.5時，CaCO3的生成量最多，9.5的初始pH值所礦化生成的CaCO3的質量最小。由以上分析可知，pH值能影響CA菌誘導CaCO3的礦化過程，偏低的pH值會使生成的CaCO3溶解，而偏高的pH值會影響CA菌的酶活性，限制CO2的水合反應過程，CA菌最佳的礦化pH值為8.5，此時的CaCO3生成量是最多的。

圖6 不同初始pH值下培養(yǎng)液中的pH值隨礦化時間的變化

圖7 不同初始pH值下培養(yǎng)液中的Ca2+濃度隨礦化時間的變化

3 討論

3.1 溫度對CA菌生長和酶活性的影響

圖8 不同初始pH值下培養(yǎng)液中所生成的CaCO3

細菌在生長繁殖過程中，都有最適宜的溫度范圍。當外界溫度高于最適溫度時，細菌蛋白質、核酸、細胞壁和細胞膜及酶類因熱力作用發(fā)生變性或凝固，活性消失，代謝發(fā)生障礙，從而導致細菌死亡。在低溫條件下時，因溫度低于最適溫度，細菌代謝活動降低，從而不再繁殖，但能較長時間維持生命，此種溫度下適用于保存菌種。細菌生長情況的好壞會影響酶活性，導致二者出現(xiàn)相似的變化規(guī)律。故而較低的溫度會抑制細菌的生長和酶活性，過高的溫度則會對細菌的生長和酶活性造成負面影響。由實驗結果可知CA菌的最佳生長溫度為25℃。

3.2 不同初始pH值對CA菌生長和酶活性的影響

在細菌生長過程中，培養(yǎng)基體系pH值變化的主要原因是在CA菌培養(yǎng)的開始階段，生長繁殖產生的CA酶，會加速CO2的水合反應，從而生成H+，使體系溶液中的pH值降低，而后隨著培養(yǎng)時間的延長，細菌分解蛋白質會產生堿性的代謝產物，同時由于后期細菌自溶，核酸類物質外泄，從而導致培養(yǎng)液的pH值升高。在不同pH值溶液體系中，隨著初始pH值的升高，細菌生長受到抑制和酶活性降低的主要因為是不同的pH值會影響微生物細胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收，從而影響細菌新陳代謝的進行，在細菌生長受到影響的同時，細菌所分泌酶的效率降低，導致酶活性的降低。溶液中過高的初始pH值會影響細菌的生長繁殖，不利于細菌的新陳代謝，并嚴重影響所分泌的碳酸酐酶活性。

3.3 Ca2+濃度對CA菌生長和酶活性的影響

不同Ca2+濃度會影響細菌的生長繁殖情況和酶活性，尤其是隨著外加Ca2+濃度的增加，細菌的生長受到嚴重抑制，對應的酶活性也較低。這主要是因為，高濃度的Ca2+會影響CA菌細胞膜周圍的滲透壓，水分將通過細胞膜從低濃度的細胞內進入到細胞周圍的溶液中，造成細胞脫水而引起質壁分離，使CA菌不能生長甚至死亡。而低濃度的Ca2+能起到維持細胞周圍滲透壓的作用，為CA菌細胞的新陳代謝提供良好的外部環(huán)境，從而加速細菌的生長，并提高對應的酶活性。由以上分析可知，50 mmol/L的Ca2+濃度有利于CA菌的生長，并且此時的酶活性也最高。

3.4 礦化產物分析

圖9是不同初始pH值下得到的CaCO3沉積物的XRD圖譜，從圖中可以看出，初始pH為7.5和8.5時，所得沉淀為方解石和球霰石復合晶型的CaCO3，初始pH值為9.5的培養(yǎng)液中所得的主要是方解石晶型的CaCO3，其中衍射角2θ = 29.40°9.40°得的主要是104）晶面，衍射角2θ =24.90°主要對應于球霰石的（110）晶面，而且除了方解石和球霰石的衍射峰，其他雜質衍射峰的強度可忽略，這表明產品純度較高，而圖中各衍射峰尖銳，則表明樣品的結晶性良好。不同初始pH值下的CaCO3沉淀物的SEM照片如圖10所示，從圖中可以看出所得的礦化產物均是不規(guī)則形貌的球形，粒徑大約為6 μm，其中，在初始培養(yǎng)液pH值為7.5時，所得CaCO3是由大量塊狀堆積而成，pH值為8.5的培養(yǎng)液所得CaCO3是由球狀和方形狀簇集而成，pH為9.5的培養(yǎng)液所得CaCO3則是由大量片狀組成的。由此可知，pH值對于所得到的CaCO3的形貌和晶型具有很大的影響，具體表現(xiàn)在不同pH值下，菌的量和酶活性對所誘導的CaCO3的形貌和晶型有所差異。

3.5 溶液中碳酸酐酶礦化機理

若溶液中沒有碳酸酐酶存在，CO2的水合反應僅僅是CO2溶于水生成H2CO3以及H2CO3在堿性條件下電離為CO32-的過程，此時CO2溶于水生成H2CO3非常緩慢，其轉化系數僅為1.3 × 10-1s-1［12］，是整個反應的限速階段。

圖9 礦化產物的XRD圖譜

圖10 礦化產物的SEM圖

而在微生物生長繁殖過程中產生的碳酸酐酶的催化作用下，CO2的水合機制發(fā)生了改變，CA能加速上述反應的進行，CO2的水合轉化系數顯著提高至1.0 × 106s-1［12，14］，是自然界的約107倍，大大提高了CO2的水合反應。

由以上微生物生長繁殖、酶活性及礦化產物的研究可知，整個微生物誘導CaCO3礦化反應過程分為以下4個階段：微生物的生長繁殖階段、礦化離子的形成階段、成核位點的吸附階段以及礦化產物的沉積階段。其中微生物在生長繁殖過程中，會產生碳酸酐酶，這極大的促進了CO2的水合反應，加快了CO2在堿性溶液中的溶解，從而產生CO32-，為礦化產物的沉積提供了必需條件；在外加鈣源存在的情況下，由于微生物細菌體自身帶負電荷，會使帶正電荷的Ca2+吸附在菌體表面，為礦化產物的沉積提供了成核位點，最終形成不同晶型的CaCO3。在整個礦化過程中，CA催化礦化離子的形成及礦化產物的沉積的具體過程如下［14，18-19，21］：

（1）碳酸酐酶活性中心的Zn2+作用于與之相連的水分子，將其去質子化形成E·ZnOH-：

（2）由于E·ZnOH-中氫鍵的存在，其中的氧原子具有很強的親核性，能夠與溶液中的水化CO2相結合，形成E·ZnHCO3

-：

（3）隨后E·ZnHCO3-中的HCO3-被溶液中的H2O取代，形成E·ZnOH2和HCO3-：

（4）在堿性的溶液中，HCO3-與OH-反應，生成CO3

2-和H2O：

（5）由于微生物菌體自身帶負電荷，會吸附Ca2+在其表面聚集：

（6）微生物菌體作為成核位點，促使礦化產物在其表面沉積：

由以上反應可得出微生物產生碳酸酐酶催化CO2的水合反應機理的過程示意圖（圖11），此水合機理的建立對探索CA菌的潛在應用具有一定的參考意義。

圖11 碳酸酐酶催化CO2水合反應機理的過程示意圖

4 結論

選用可產生碳酸酐酶的膠質芽孢桿菌進行培養(yǎng)，研究了溫度、pH值和Ca2+濃度對CA菌生長和酶活性的影響，得出CA菌最佳的培養(yǎng)條件為25℃、pH值為8.5的培養(yǎng)基，Ca2+濃度為50 mmol/L，此時的細菌生長繁殖良好，并且酶活性也較高。同時研究了溶液中微生物產生碳酸酐酶誘導CaCO3沉積的礦化機理，微生物所產生的CA能夠加速CO2的水合反應，在堿性條件中，生成CO32-，當有外加鈣源時，能夠與Ca2+反應進而生成CaCO3。