蘇云金芽孢桿菌菌劑培養(yǎng)條件的優(yōu)化及毒力測定

李洋 公旭彤 劉想 王加男 秦秀麗

【摘? ?要】 通過單因素及正交試驗(yàn)對蘇云金芽孢桿菌菌劑的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明最適宜培養(yǎng)基配方為馬鈴薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO42g/L，MgSO42g/L，pH8.0;最適培養(yǎng)條件為溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間48h。

【關(guān)鍵詞】 蘇云金芽孢桿菌;菌劑;培養(yǎng)基;毒力測定

中圖分類號：S312? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)識別碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2096-1073（2020）09-0052-53

Optimization of Culture Conditions and Determination of Virulence of Bacillus Thuringiensis

LI Yang， GONG Xutong， LIU Xiang， WANG Jianan， QIN Xiuli*

（Jilin Agricultural Science and Technology University? ?Jilin， Jilin? ?132101）

[Abstract] The culture conditions of Bacillus thuringiensis agent were optimized by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal medium formula was potato powder 20g/L， peptone 20g/L， KH2PO42g/L， MgSO42g/L， pH8.0. The optimum culture conditions were 35℃ and 48h.

[Key words] bacillus thuringiensis; bactericide; culture medium; virulence determination

在農(nóng)作物生產(chǎn)中，經(jīng)常會發(fā)生蟲害，與化學(xué)農(nóng)藥相比，微生物殺蟲劑已成為全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)[1-2]。其中蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，其生長繁殖快，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，易于人工培養(yǎng)，對直翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目等多種農(nóng)業(yè)害蟲有很強(qiáng)毒殺作用，是目前世界上應(yīng)用最廣的細(xì)菌性殺蟲劑。本試驗(yàn)對蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為蘇云金芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1? 試驗(yàn)材料

蘇云金芽孢桿菌WY-197菌株，為吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;牛肉膏蛋白胨斜面試管培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂 20g/L，分裝試管，常規(guī)滅菌后備用;液體菌種培養(yǎng)基：不加瓊脂，裝入250mL三角瓶中，每瓶裝入量100mL，常規(guī)滅菌后備用;碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L;氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L;無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L。以上培養(yǎng)基調(diào)pH值為7.4-7.6。

1.2? 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

培養(yǎng)溫度設(shè)25、30、35、37、40℃ 五個(gè)水平，培養(yǎng)72h;培養(yǎng)時(shí)間設(shè)24h、36h、48h、60h、72h 五個(gè)水平;培養(yǎng)基初始pH值設(shè)6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五個(gè)水平。對芽孢進(jìn)行染色顯微觀察，對菌劑進(jìn)行毒力測定，考查芽孢釋放的最適培養(yǎng)溫度、時(shí)間、pH值。

1.3? 培養(yǎng)基質(zhì)及配方的優(yōu)化

碳源、氮源、無機(jī)鹽的單因素比較：在供試碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、馬鈴薯粉、玉米淀粉各10g/L;在供試氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入酵母膏、蛋白胨、大豆（煮熟粉碎）、魚粉（粉碎）、麥麩（粉碎）各10g/L;在供試無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加FeSO4、KH2PO4、MgSO4各4g/L，以及FeSO42g/L+KH2PO42g/L、FeSO42g/L+MgSO42g/L、KH2PO42g/L+MgSO42g/L。

培養(yǎng)基質(zhì)適宜配方綜合比較：在碳源、氮源、無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（見表1），配制9種培養(yǎng)基以得出最適培養(yǎng)基配方。

1.4? 毒力測定[3]

從淘寶平臺購得黃粉蟲活體鮮活種蟲以及飼料，用規(guī)格為長18cm×寬13cm×高6cm塑料盒為裝蟲容器，每個(gè)塑料盒內(nèi)放50g飼料，噴施10mL的菌液，使菌液與飼料充分拌勻，然后放入20只幼蟲，塑料盒上用紗布覆蓋，在溫度是20℃～25℃，暗光下飼養(yǎng)，同時(shí)以無菌水處理設(shè)空白對照，計(jì)算72h內(nèi)幼蟲死亡率，根據(jù)幼蟲死亡率確定最適培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 培養(yǎng)條件對菌劑毒力的影響

不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間及不同pH對菌劑毒力的影響結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3。圖1結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，喂飼昆蟲的死亡為85%;當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，喂飼昆蟲的死亡率最高達(dá)到91%;當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，喂飼昆蟲的死亡為32%，當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到40℃，幾乎觀察不到芽孢。說明當(dāng)溫度超過35℃后不利于芽孢的形成，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，不能形成芽孢;圖2結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，涂片觀察芽孢數(shù)量逐漸增多，喂飼昆蟲的死亡率也在增加，菌劑培養(yǎng)48h時(shí)，喂飼昆蟲的死亡率達(dá)到最高，培養(yǎng)時(shí)間60h以后，菌劑中芽孢的數(shù)量幾乎沒有增加，喂飼昆蟲的死亡率沒有升高;圖3結(jié)果表明：隨著菌劑中pH值升高，噴施飼料喂飼昆蟲其死亡率逐漸升高，但在中性及偏酸性條件下，昆蟲死亡率升高不明顯，當(dāng)pH值超過7.0時(shí)昆蟲死亡率升高較快，當(dāng)pH值為8.0 時(shí)昆蟲死亡率最高，當(dāng)pH值達(dá)到8.5時(shí)，昆蟲的死亡率有所下降。

2.2? 碳源、氮源、無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

對不同碳源、氮源、無機(jī)鹽的菌液進(jìn)行毒力測定的試驗(yàn)結(jié)果分別見圖4、圖5、圖6。圖4結(jié)果表明：以馬鈴薯粉和葡萄糖為碳源的菌劑，噴施后昆蟲死亡率最高，隨后依次是蔗糖>麥芽糖>玉米淀粉，由于馬鈴薯粉原料易得，比較適合于生產(chǎn)中選用;圖5結(jié)果表明：以蛋白質(zhì)胨為氮源的菌劑噴施飼料喂飼昆蟲，昆蟲死亡率最高，表明菌劑中芽孢的數(shù)量最多，其次為是酵母膏，隨后依次為大豆>魚粉>麥麩;圖6結(jié)果表明：培養(yǎng)基質(zhì)中含有KH2PO42g/L+MgSO42g/L兩種無機(jī)鹽的菌劑噴施飼料喂飼昆蟲時(shí)，菌劑中芽孢的數(shù)量最多，昆蟲死亡率最高，含有其他無機(jī)鹽的菌劑昆蟲的死亡率次序?yàn)镵H2PO4+MgSO4>FeSO4+KH2PO4>FeSO4+MgSO4>KH2PO4>MgSO4>FeSO4。

2.3? 芽孢形成最適培養(yǎng)基配方的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，從表2可知：菌劑培養(yǎng)基配方的最佳組合為A3B3C2D2，即馬鈴薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO42g/L，MgSO42g/L。從極差R可知，培養(yǎng)基中各組分對芽孢形成及菌劑毒力影響的排序?yàn)榈鞍纂?馬鈴薯粉>MgSO4 >K2HPO4。

3? 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，蘇云金芽孢桿菌WY-197菌株產(chǎn)芽孢適宜培養(yǎng)基的配方：馬鈴薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO42g/L，MgSO42g/L，pH8.0;最適培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h，在此條件下進(jìn)行培養(yǎng)，菌劑產(chǎn)芽孢數(shù)量最多，毒力最強(qiáng)。微生物菌劑從實(shí)驗(yàn)室走向應(yīng)用是一個(gè)復(fù)雜的過程，本試驗(yàn)所測得的菌劑毒力，是在實(shí)驗(yàn)室條件下所測得的，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中菌劑施用后，對菌劑毒力的影響因素更為復(fù)雜，還需要進(jìn)行深入的研究和探索。

參考文獻(xiàn)：

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（編輯：李丹）