鄧江 黎相照

【摘要】 目的 探討固定液溫度對冰凍切片質(zhì)量的影響。方法 選取南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院冰凍新鮮肺組織20例、乳腺組織20例、腸組織20例、甲狀腺組織20例和腦組織20例， 每個病例取一塊組織， 每塊組織連續(xù)切片4片， 分成A組、B組、C組、D組， 每組100片。A組采用室溫AA固定液中固定1 min;B組采用低溫恒冷AA固定液中固定1 min;C組采用低溫恒冷AA固定液中固定1 min， 然后熱風(fēng)固定10 s;D組采用低溫恒冷固定液中固定15 min;常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（HE染色）進(jìn)行HE切片染色， 觀察四組的細(xì)胞形態(tài)差異、細(xì)胞核和胞漿的染色效果。結(jié)果 A、C組冰凍切片組織細(xì)胞輕微收縮， HE染色均勻， 細(xì)胞核染色深藍(lán)色， 核漿對比度較好;B組冰凍切片細(xì)胞輕微腫脹， 切面易發(fā)生裂隙， HE染色不均勻， 細(xì)胞核染色灰白灰藍(lán)色， 核漿對比度較差;D組冰凍切片組織細(xì)胞局部輕微腫脹， HE染色局部不均勻， 細(xì)胞核染色深藍(lán)色或灰藍(lán)色， 核漿對比度較差。A組固定液染色綜合評分為（93.99±0.69）分， B組固定液染色綜合評分為（85.95±1.16）分， C組固定液染色綜合評分為（93.61±0.62）分， D組固定液染色綜合評分為（91.85±0.57）分， 四組固定液染色綜合評分比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 組織冰凍切片經(jīng)室溫AA固定液固定后， 細(xì)胞形態(tài)自然， HE染色細(xì)胞核染色鮮艷， 核漿對比度較好。

【關(guān)鍵詞】 組織冰凍切片;AA固定液;室溫固定;低溫恒冷固定

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.22.091

Effect of fixation fluid temperature on the quality of frozen sections? ?DENG Jiang， LI Xiang-zhao. Department of Pathology， Second Peoples Hospital of Longgang District， Shenzhen 518112， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the effect of fixation fluid temperature on the quality of frozen sections. Methods? ?20 cases of frozen fresh lung tissue， 20 cases of breast tissue， 20 cases of intestinal tissue， 20 cases of liver tissue， 20 cases of thyroid tissue and 20 cases of brain tissue in Nanfang Hospital of Southern Medical University were selected. 1 piece of tissue was taken from each case， and each piece of tissue was cut into 4 pieces， which were divided into group A， group B， group C and group D， with 100 pieces in each group. Group A was fixed in room temperature AA fixation fluid for 1 min. Group B was fixed in low temperature and constant cooling AA fixation fluid for 1 min. Group C was fixed in low temperature and constant cold AA fixation fluid for 1 min， followed by hot air fixation for 10 s. Group D was fixed in low temperature and constant cooling fixation fluid for

15 min. Hematoxylin eosin staining （HE staining） was used to observe the cell morphology， nuclear and cytoplasmic staining effect of the four groups. Results? ?In group A and C， the frozen section cells contracted slightly， the HE staining was evenly， the nuclear staining was dark blue， and the contrast of nuclear plasma was good. In group B， the cells in frozen section were slightly swollen， the section was easy to crack， the HE staining was uneven， the nucleus staining was gray and gray blue， and the nucleocytoplasmic contrast was poor. In group D， the frozen section tissue cells were slightly swollen， the HE staining was uneven， and the nuclear staining was dark blue or gray blue， and the nucleocytoplasmic contrast was poor. The comprehensive score of fixation fluid staining of group A was （93.99±0.69） points， which was （85.95±1.16） points in group B， （93.61±0.62） points in group C and （91.85±0.57） points in group D. There was statistically significant difference in comprehensive score of fixation fluid staining among the four groups （P<0.05）. Conclusion? ?After frozen tissue sections are fixed with room temperature AA fixation fluid， the morphology of the cells is natural， the nucleus stain with HE is stained brightly， and the nucleocytoplasmic contrast is good.

【Key words】 Frozen tissue sections; AA fixation fluid; Room temperature fixation; Low temperature and constant cooling fixation

冰凍切片是借助低溫恒冷條件使組織迅速凍結(jié)達(dá)到一定硬度進(jìn)行切片的一種方法， 具有快速、方便的特點， 而大范圍用于臨床手術(shù)中的快速病理診斷， 因此做出高質(zhì)量的冰凍切片是手術(shù)中確診病變性質(zhì)、決定手術(shù)范圍的最重要的環(huán)節(jié)。一張好的冰凍HE切片主要取決于切片、固定和染色， 這三方面環(huán)環(huán)相扣， 相互影響。其中由于組織固定因素影響組織細(xì)胞形態(tài)的改變， 染色效果不良， 對結(jié)果的診斷影響最大， 遠(yuǎn)比其他操作因素引起的組織細(xì)胞形態(tài)改變更難把握[1]。因此， 本實驗為提高冰凍切片染色效果， 選擇室溫AA固定液和低溫恒冷AA固定液分別對組織冰凍切片快速固定， 經(jīng)HE染色后觀察其染色效果。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2019年4～9月的冰凍新鮮肺組織20例、乳腺組織20例、腸組織20例、甲狀腺組織20例和腦組織20例。每例組織連續(xù)切片4片， 分為A、B、C、D組， 每組100片。

1. 2 設(shè)備 冷凍切片機(jī)， 冰凍自動HE染色機(jī)。

1. 3 主要試劑 OCT冷凍包埋劑， AA液（由95%乙醇A∶乙酸A=99.75%∶0.25%組成）， 新鮮Harris蘇木素染液， 0.3%鹽酸乙醇溶液， 0.5%氨水溶液， 0.5%水溶伊紅， 75%乙醇， 85%乙醇， 95%乙醇， 無水乙醇， 二甲苯， 中性樹膠。

1. 4 取材及切片制作

1. 4. 1 新鮮送檢組織取材大小約為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm， 每個病例取一塊組織， 每塊組織連續(xù)切片4張， 分成4組， 每組100張， 切片厚度3～4 μm。

1. 4. 2 HE切片的制作 A組粘片后立即放入室溫（20～26 ℃）AA固定液中固定1 min;B組粘片后立即放入低溫恒冷AA固定液中固定1 min;C組粘片后立即放入低溫恒冷AA固定液中固定1 min， 然后吹風(fēng)筒低檔熱風(fēng)加熱固定10 s;D組粘片后立即放入低溫恒冷AA固定液中固定15 min;固定后統(tǒng)一置于全自動染色機(jī)內(nèi)進(jìn)行HE染色。染色步驟如下：新鮮蘇木素染液染色3 min， 自來水漂洗5 s， 0.3%鹽酸乙醇溶液分化1 s， 自來水漂洗5 s， 0.5%氨水溶液藍(lán)化5 s， 自來水漂洗5 s， 0.5%水溶伊紅染色10 s， 自來水漂洗5 s， 75%乙醇脫水5 s， 85%乙醇脫水5 s， 95%乙醇脫水5 s， 無水乙醇Ⅰ脫水10 s， 無水乙醇Ⅱ脫水10 s， 二甲苯Ⅰ透明5 s， 二甲苯Ⅱ透明5 s， 中性樹膠封片。

1. 5 染色效果及判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察各組切片染色后組織細(xì)胞形態(tài);HE染色的均勻性、細(xì)胞核著色和核漿對比清晰度。染色效果在顯微鏡下依照《病理切片質(zhì)量基本標(biāo)準(zhǔn)》[2]中“組織切片制備的基本要求”進(jìn)行判定， 由兩名高年資醫(yī)師對四組冰凍切片進(jìn)行觀察， 各自給出判定結(jié)果， 若結(jié)果不一致邀請專家閱片或細(xì)化實驗， 經(jīng)協(xié)商后確定最終結(jié)果， 采用雙盲打分。細(xì)胞核著色灰淡或過藍(lán)， 減5分;紅（細(xì)胞質(zhì)）與藍(lán)（細(xì)胞核）對比不清晰， 減5分。

1. 6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗， 組間評分比較采用One-Way ANOVA檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 組織細(xì)胞形態(tài) A和C組細(xì)胞輕微收縮;B組細(xì)胞輕微腫脹， 切面易發(fā)生裂隙現(xiàn)象; D組局部組織細(xì)胞輕微腫脹;低溫恒冷固定后的組織細(xì)胞形態(tài)有差異， 組織細(xì)胞形態(tài)改變以甲狀腺組織最明顯， 不同固定方式導(dǎo)致的組織細(xì)胞形態(tài)差異。見表1。

2. 2 組織細(xì)胞染色效果 A、C組切片染色均勻， 細(xì)胞核染色深藍(lán)色， 細(xì)胞漿染色鮮艷， 核漿對比度較好， 綜合評分分別為（93.99±0.69）分和（93.61±0.62）分， HE染色見圖1和圖3;B組切片染色不均勻， 細(xì)胞核染色灰藍(lán)灰白色， 細(xì)胞漿染色較淡， 核漿對比度較差， 綜合評分為（85.95±1.16）分， HE染色見圖2。D組切片染色局部少許不均勻， 細(xì)胞核染色深藍(lán)色或灰藍(lán)色， 細(xì)胞漿染色局部較淡， 核漿對比度一般， 綜合評分為（91.85±0.57）分， HE染見圖4。A、B、C、D組組間固定液染色評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;經(jīng)室溫固定的冰凍切片HE染色結(jié)果綜合評分更高， 染色效果最佳。

3 討論

組織切片經(jīng)過固定液能將蛋白質(zhì)、酶、糖等沉淀或凝固成不溶性物質(zhì)[3]， 保持組織細(xì)胞與正常生活時的形態(tài)相似。在AA固定液中， 乙醇能迅速沉淀球蛋白和核蛋白。醋酸能沉淀核蛋白， 穿透力強(qiáng)， 且醋酸能使染色體的保存如同生活時一樣， 并能將未分裂的細(xì)胞核染色質(zhì)沉淀成為可以染色的塊狀體， 故細(xì)胞核染色顯得清楚;同時， 醋酸有使組織膨脹的作用[4]， 可以抵消乙醇所引起的組織收縮， 能較好的保持組織學(xué)形態(tài)。

在冰凍切片制片過程中， 規(guī)定20～25 min內(nèi)完成制片[5]， 所以固定方法非常重要。常見固定方法有室溫固定和低溫恒冷固定。冰凍切片在室溫（20～26 ℃）環(huán)境下固定， 由于溫度遠(yuǎn)高于低溫恒冷切片機(jī)內(nèi)， 固定液分子擴(kuò)散較快， 在有限的時間內(nèi)組織細(xì)胞成分固定充分， HE染色均勻， 細(xì)胞核染色深藍(lán)色， 核漿對比度較好。冰凍切片于低溫恒冷切片機(jī)內(nèi)固定， 因冷凍切片機(jī)室內(nèi)平均溫度-20 ℃， 低溫環(huán)境下分子擴(kuò)散速度慢， 在有限的時間內(nèi)組織細(xì)胞成分固定不充分， 導(dǎo)致細(xì)胞腫脹明顯， HE染色不均勻， 細(xì)胞核染色灰藍(lán)色， 核漿對比度較差。在低溫恒冷條件下固定液內(nèi)固定1 min后再用熱風(fēng)加速固定10 s， 染色效果明顯改善。在低溫恒冷條件下延長固定液的固定時間染色效果雖有改善， 但局部仍然欠佳， 染色效果仍不理想， 而且固定太耗時間。通過實驗得出， 固定液溫度對冰凍切片染色質(zhì)量有影響;室溫固定冰凍切片染色效果最佳;如果固定液溫度低于切片溫度， 冰凍切片置入低溫恒冷固定液內(nèi)固定易觸發(fā)微冰晶效應(yīng)， 引起的組織細(xì)胞內(nèi)液體的腫脹， 導(dǎo)致核發(fā)生腫脹或核空泡， 核染色差。低溫固定效應(yīng)在體液豐富的組織切片中最突出， 本次實驗中甲狀腺組織的冰凍切片最為明顯;同一切面病變組織較正常組織明顯。

在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)， 各種人為操作也可以導(dǎo)致染色不均勻， 例如冷凍包埋速度過慢產(chǎn)生的冰晶[6， 7]， 切片時用力不均勻或切片時跳刀[8]， 切片后置于空氣中時間過長， 還有冰凍組織因診斷需要重復(fù)切片而反復(fù)冷凍， 都可發(fā)生染色不均勻現(xiàn)象。但只要工作認(rèn)真負(fù)責(zé)是可以避免這些人為因素的發(fā)生， 目前冰凍固定液種類繁多， 其他固定液是否發(fā)生低溫固定效應(yīng)還需進(jìn)一步摸索。

綜上所述， 采用室溫AA固定液固定冰凍切片是一種較為滿意和實用的固定方式， 組織形態(tài)自然， 細(xì)胞核著色更藍(lán)， 核漿對比度好， 色彩更鮮艷。

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[收稿日期：2020-02-21]