許超，邱黎霞，張漫，羅雪平，李荊，郭滿盈(中國(guó)人民解放軍陸軍第72集團(tuán)軍醫(yī)院檢驗(yàn)病理科，浙江湖州 313000)

DNA修復(fù)基因——X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因3(XRCC3)是單鏈斷裂修復(fù)系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)基因；研究表明，在含鉑類化療方案治療的肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤患者的病灶組織中XRCC3能夠修復(fù)DNA損傷，誘發(fā)鉑類耐藥[1]，故而檢測(cè)XRCC3基因多態(tài)性對(duì)NSCLC患者化療方案的選擇具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。腫瘤組織進(jìn)行DNA分析是目前檢測(cè)XRCC3基因多態(tài)性最可靠的方法，但存在標(biāo)本不易獲取的缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[2]。另有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)外周血標(biāo)本分析XRCC3基因多態(tài)性，但外周血DNA獲取主要源于白細(xì)胞，而非腫瘤細(xì)胞，影響了其檢測(cè)的準(zhǔn)確性[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是腫瘤遷移和侵襲的主要機(jī)制；腫瘤細(xì)胞從病灶處脫落后進(jìn)入外周血循環(huán)，部分定植于其他臟器，形成轉(zhuǎn)移灶[4]。以CTC為標(biāo)本的檢測(cè)技術(shù)在較好地提供腫瘤細(xì)胞信息的同時(shí)，還便于多次、反復(fù)獲取。本研究擬分別在腫瘤組織、外周血及CTC標(biāo)本中檢測(cè)NSCLC患者XRCC3基因多態(tài)性，以期探討CTC能否替代腫瘤組織用于NSCLC患者XRCC3基因多態(tài)性分析。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年1月至12月于本院普外科就診的中晚期NSCLC患者84例。其中男64例，女20例，年齡(57.3±8.3)歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的原發(fā)性NSCLC患者，不伴有其他腫瘤史；(2)無(wú)化療、生物療法等抗腫瘤治療史。TNM分期：Ⅲa期20例，Ⅲb期12例，Ⅳ期52例；病理分型：腺癌50例，鱗癌24例，腺磷癌10例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2018-ZL03)，患者均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 GS-20型負(fù)壓抽吸系統(tǒng)(上海硅萊醫(yī)療器械公司)；Light Cycler 480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(瑞士Roche公司)；Olympus BX63型自動(dòng)熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CelDocEZ型全自動(dòng)免染凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)。CTC免疫組化鑒定試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司)；FITC標(biāo)記小鼠抗人CD45多克隆抗體(武漢友聯(lián)特生物公司)；DAPI/細(xì)胞核染色試劑(上海碧云天生物公司)；EB染色試劑盒(重慶邁凱公司)；人染色體著絲粒特異性探針雜交混合液(上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑公司)；Trizol試劑(北京柏萊斯特科技公司)；BstEⅡ限制性內(nèi)切酶(上海連橋生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 術(shù)中或病理檢查時(shí)收集患者肺癌組織標(biāo)本約2 g用于總RNA抽提，采用Trizol試劑提取組織RNA，變性梯度凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度，取濃度>20 ng/μL、純度>2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，置于-80 ℃保存。此外，收集化療前患者清晨空腹外周靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存。

1.3.2CTC富集、鑒定與熒光原位雜交 取患者經(jīng)EDTA-K2抗凝的外周靜脈血2 mL，經(jīng)1%多聚甲醛在室溫下預(yù)固定10 min，使用負(fù)壓抽吸系統(tǒng)過(guò)濾外周血，PBS洗滌過(guò)濾得到的殘余血液，4%多聚甲醛再次固定，將富集細(xì)胞的濾膜37 ℃烘干，根據(jù)CellSearch?標(biāo)準(zhǔn)[CK8/18/19+，含有細(xì)胞核的CD45-細(xì)胞(DAPI+)[5]]對(duì)CTC進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色鑒定。使用甲醇和冰乙酸混合液(3∶1)透化處理膜上細(xì)胞，加入30 μL人染色體著絲粒特異性探針雜交混合液，與濾膜上的細(xì)胞充分接觸，置于雜交儀(76 ℃變性)中37 ℃溫育12 h，次日洗膜除去探針雜交液，20 g/L胎牛血清封閉30 min，滴加5 μL FITC標(biāo)記小鼠抗人CD45多克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃避光靜置2 h，加入30 μL DAPI染料，4 ℃靜置2 h。置于Olympus BX63型自動(dòng)熒光顯微鏡下隨機(jī)選取20個(gè)視野，計(jì)數(shù)CTC(呈亮藍(lán)色和橘紅色)的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.3XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)基因型分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法分析XRCC3基因型。根據(jù)GenBank中XRCC3基因Thr241Met位點(diǎn)(C/T，rs861539)的序列號(hào)(AY181026)，由上海捷瑞生物公司采用Oligo7引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物序列：5′-CCTTGCTCTGTCCCCTCTGT-3′，下游引物序列：5′-AGTCCCCACCCTCTTGTTCA-3′，退火溫度57 ℃，產(chǎn)物片段大小630 bp。PCR反應(yīng)總體積為30 μL，包括10×PCR Buffer 10 μL、dNTP mix 3 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、耐熱DNA聚合酶2 μL、DNA模板1 μL、雙蒸餾水12 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BstEⅡ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切40 min，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行EB染色，采用CelDocEZ型全自動(dòng)免染凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)并觀察電泳結(jié)果，根據(jù)酶切后各片段大小確定XRCC3單核苷酸多態(tài)性和基因型。結(jié)果判讀：XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)BstEⅡ限制性內(nèi)切酶酶切后出現(xiàn)481 bp、265 bp、193 bp 3條條帶，其中突變純合型為481 bp，雜合型為481 bp、265 bp、193 bp，野生純合型為265 bp、193 bp。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料使用百分比表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法；α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果 采用PCR-RFLP法可檢出突變純合型、雜合型及野生純合型3種基因型，各基因型分布情況符合遺傳平衡定律(χ2=17.592，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

2.2不同臨床病理參數(shù)的NSCLC患者CTC個(gè)數(shù)比較 CTC個(gè)數(shù)在不同性別、年齡、病理類型及臨床分期的NSCLC患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1不同臨床病理參數(shù)的NSCLC患者CTC個(gè)數(shù)比較[n(%)]

2.3不同標(biāo)本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性的一致性分析 結(jié)果顯示，腫瘤組織、CTC及外周血標(biāo)本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性陽(yáng)性率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。以腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，CTC檢測(cè)XRCC3基因Thr241Met(rs861539)基因型與腫瘤組織基因位點(diǎn)多態(tài)性的一致率為95.24%(80/84)；外周血標(biāo)本與腫瘤組織基因位點(diǎn)多態(tài)性的一致率為76.19%(64/84)。CTC檢測(cè)基因位點(diǎn)多態(tài)性的一致率明顯高于外周血標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.482，P=0.000)。

表2不同標(biāo)本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性的陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.4XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性在不同年齡、病理類型及TNM分期的NSCLC患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3不同臨床病理參數(shù)NSCLC患者XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性比較[n(%)]

3 討論

人類XRCC3基因首先從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞突變體系中分離得到，其能夠編碼1個(gè)包含346個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，并作為一種關(guān)鍵的DNA損傷修復(fù)基因，參與DNA單鏈斷裂和堿基損傷的修復(fù)[5-7]。相關(guān)研究顯示，XRCC3基因多態(tài)性與膀胱癌、食管癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[8-10]。亦有研究顯示，XRCC3基因多態(tài)性可影響鉑類、卡鉑、奧沙利鉑等鉑類化療藥物敏感性及治療預(yù)后效果[11]。本研究結(jié)果顯示，XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性在不同年齡、病理類型及TNM分期的NSCLC患者之間存在明顯差異，提示XRCC3基因多態(tài)性與NSCLC患者年齡等臨床病理參數(shù)明顯相關(guān)。另有研究顯示，XRCC3基因rs861534和rs8615302位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌的內(nèi)分泌治療風(fēng)險(xiǎn)和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[11-13]；XRCC3基因Thr241Met多態(tài)性可能參與胃癌易感性[14]。結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，XRCC3基因多態(tài)性在與NSCLC患者年齡等臨床病理參數(shù)呈明顯相關(guān)的同時(shí)，還可能與肺癌易感性、化療耐藥性等存在關(guān)聯(lián)，但需進(jìn)一步深入研究。

由于NSCLC患者外周血易于采集，創(chuàng)傷小，DNA提取難度較低，因此目前相關(guān)研究多集中于檢測(cè)外周血XRCC3基因型[15]；但由于DNA主要來(lái)自于外周血中的白細(xì)胞，對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性造成了不良影響[16]。CTC指進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞，主要來(lái)源于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤病灶組織，基因組構(gòu)成與腫瘤組織具有高度一致性[11]。目前研究認(rèn)為，以腫瘤組織為標(biāo)本檢測(cè)得到的XRCC3基因多態(tài)性準(zhǔn)確性最高，但獲得難度較高[17]；因此，探究CTC檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因突變是否能夠替代腫瘤組織具有重要意義。本研究以腫瘤組織檢測(cè)的XRCC3基因多態(tài)性為金標(biāo)準(zhǔn)，并與CTC和外周血檢測(cè)的XRCC3基因多態(tài)性進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，腫瘤組織、CTC及外周血檢測(cè)XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性的陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；我們進(jìn)一步以腫瘤組織檢測(cè)的XRCC3基因多態(tài)性為金標(biāo)準(zhǔn)，并比較CTC與外周血檢測(cè)結(jié)果的一致率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC檢測(cè)XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位點(diǎn)多態(tài)性的一致性高達(dá)95.24%，明顯高于外周血標(biāo)本的76.19%,提示CTC能夠較好地反映出肺癌組織基因型。目前臨床上還可直接從外周血中分離和富集CTC，準(zhǔn)確性高，無(wú)需通過(guò)手術(shù)獲取腫瘤組織標(biāo)本。但亦有研究顯示，由于目前的CTC捕捉技術(shù)無(wú)法保證百分百的純度，臨床應(yīng)用中需對(duì)捕獲的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以確定為CTC細(xì)胞，進(jìn)而減少檢測(cè)的假陽(yáng)性率和假陰性率[18]；此外，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，CTC的數(shù)目呈動(dòng)態(tài)變化的同時(shí)，其攜帶的分子標(biāo)志物也在不斷變化[19]。因此，臨床應(yīng)用CTC檢測(cè)NSCLC患者基因型時(shí)應(yīng)綜合考慮以上因素，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。雖然本研究納入的患者均無(wú)化療、生物療法等抗腫瘤治療史，避免了化療等因素對(duì)XRCC3基因型的影響，但因此所納入的樣本量偏少，在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。