浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)的性能確認(rèn)

王藝芳，葛文超，李俊英，呂永磊，方建華

（河南省紅十字血液中心，河南 鄭州450012）

按照《血站實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理規(guī)范》[1]和《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015 版）》[2]的要求，檢測(cè)設(shè)備在正式投入使用之前應(yīng)經(jīng)過(guò)確認(rèn)，核酸檢測(cè)（nucleic acid test, NAT）設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行分析靈敏度驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立血液檢測(cè)試劑的評(píng)價(jià)、選擇和確認(rèn)程序。 因此，在核酸檢測(cè)設(shè)備投入使用前，需要通過(guò)性能確認(rèn)了解其性能，確認(rèn)是否達(dá)到預(yù)期，滿足實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)需要。 浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)于2018 年7 月份引進(jìn)本實(shí)驗(yàn)室，筆者通過(guò)通量測(cè)試、壓力測(cè)試、靈敏度驗(yàn)證和平行試驗(yàn)等方面,完成對(duì)浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)性能的評(píng)估,為其他實(shí)驗(yàn)室的核酸檢測(cè)系統(tǒng)性能確認(rèn)工作提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2018 年08 月本中心采集的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本。 獻(xiàn)血者均符合國(guó)家《獻(xiàn)血者健康檢查要求》中的相關(guān)要求。 采集每人份血液同時(shí)留取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）樣管和NAT 樣管，其中NAT 標(biāo)本在采樣后4h 內(nèi)于2~8 ℃1760g 離心20 min,2~8℃保存，24h 內(nèi)上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要試劑、 儀器和NAT 試劑廠家 乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（1 型）核酸檢測(cè)試劑盒（上海浩源生物科技有限公司, 批號(hào)：MF2 0180101）;乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（1+2 型）核酸檢測(cè)試劑盒（蘇州華益美生物科技有限公司，批號(hào)：MA20180403 等）。 配套耗材均由試劑公司提供，均在有效期內(nèi)使用。 核酸檢測(cè)使用：ChiTaSBSS1200 核酸提取系統(tǒng)（美國(guó)PE公司）,Hamilton Star 全自動(dòng)混樣儀（瑞士HAMILTON 公司），ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）,低溫大容量離心機(jī)KUBOTA 8730（日本KUB OTA 公司）。

1.3 血清盤 北京康徹斯坦核酸系列血清評(píng)價(jià)盤(系統(tǒng)性能驗(yàn)證盤), 有36 份編號(hào)為P 系列樣本,其中包括HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA 及陰性的樣本，見(jiàn)表1，進(jìn)行8 人份混樣檢測(cè)。北京康徹斯坦核酸系列血清評(píng)價(jià)盤（分析靈敏度）, 分別由WHO HBV DNA 標(biāo)準(zhǔn)品（10/26 4）稀釋至9 IU/ml（6 個(gè)）、6 IU/ml（20 個(gè)）、3 IU/ml（6 個(gè)），WHO HCV RNA 標(biāo)準(zhǔn)品（06/102）稀釋至36 IU/ml（6 個(gè)）、24 IU/ml（20 個(gè)）、12 IU/ml（6 個(gè)），WHO HIV RNA-1標(biāo)準(zhǔn)品（10/152）稀釋至72 IU/ml（6 個(gè)）、48 IU/ml（20 個(gè)）、24 IU/ml（6 個(gè)），進(jìn)行單人份檢測(cè)。

1.4 方法

1.4.1 通量測(cè)試 14h 內(nèi)連續(xù)進(jìn)行兩個(gè)批次的8 混檢模式檢測(cè)，每個(gè)批次均是滿負(fù)荷，含質(zhì)控品和樣本。 所用樣本為實(shí)驗(yàn)室當(dāng)日檢測(cè)過(guò)的樣本，以驗(yàn)證在滿負(fù)荷連續(xù)運(yùn)行14h 內(nèi)的檢測(cè)量。

1.4.2 壓力測(cè)試 使用浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行8 混檢模式檢測(cè),連續(xù)運(yùn)行檢測(cè)3d,共計(jì)檢測(cè)樣本2 232份（未包含質(zhì)控品），觀察并記錄檢測(cè)系統(tǒng)的滿負(fù)荷的運(yùn)行狀況以驗(yàn)證在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行時(shí)的系統(tǒng)穩(wěn)定性。

1.4.3 分析靈敏度驗(yàn)證 使用浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)分析靈敏度血清評(píng)價(jià)盤進(jìn)行單檢模式檢測(cè)，將HBV、HCV 和HIV-1 3 種病毒標(biāo)準(zhǔn)品隨機(jī)分布進(jìn)行檢測(cè)， 并用IBM SPSS Statistics 19 分別分析其95%檢出限。

1.4.4 平行試驗(yàn) 使用2018 年8 月6 日-11 日華益美檢測(cè)過(guò)的樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 抗交叉污染 使用13 個(gè)陰性血漿樣本和53個(gè)陽(yáng)性血漿樣本 （含HBV、HCV、HIV 強(qiáng)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性樣本），交替放置8 混檢模式檢測(cè)。

1.4.6 檢測(cè)能力驗(yàn)證 采用浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)康徹斯坦血清盤進(jìn)行8 混檢模式進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 通量測(cè)試 1 臺(tái)浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)在14h 內(nèi)可以完成1 488 份樣本的混樣模式檢測(cè)，運(yùn)行過(guò)程中無(wú)故障發(fā)生。

2.2 壓力測(cè)試 每天進(jìn)行744 份樣本混樣模式檢測(cè),連續(xù)3d，模擬實(shí)際運(yùn)行過(guò)程中最大的檢測(cè)壓力,在滿負(fù)荷狀態(tài)下連續(xù)運(yùn)行3d，無(wú)故障和無(wú)效結(jié)果。

2.3 分析靈敏度驗(yàn)證 分析靈敏度驗(yàn)證的結(jié)果見(jiàn)表2，單人份檢測(cè)HBV DNA 95%檢出限為6.00 IU/ml，HCV RNA 95%檢 出 限 為24.00 IU/ml，HIV RNA-1 95%檢出限為48.00 IU/ml。

2.4 平行試驗(yàn) 使用華益美檢測(cè)過(guò)的樣本進(jìn)行檢測(cè)，有1 個(gè)pool 浩源混檢陽(yáng)性而華益美混檢陰性，拆分陰性，其他結(jié)果均一致。

2.5 抗交叉污染 66 個(gè)樣本試驗(yàn)，53 個(gè)陽(yáng)性樣本均檢測(cè)為有反應(yīng)性，13 個(gè)陰性樣本均為無(wú)反應(yīng)性。陽(yáng)性孔均未對(duì)鄰近孔位造成交叉污染。

2.6 檢測(cè)能力驗(yàn)證 對(duì)康徹斯坦血清盤進(jìn)行8 混檢模式進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與血清盤說(shuō)明書(shū)參考結(jié)果符合度100%。 見(jiàn)表1。

3 討論

病毒核酸檢測(cè)技術(shù)是直接檢測(cè)病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱。 相比酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，血液病毒核酸檢測(cè)技術(shù)可以有效縮短抗原抗體免疫檢測(cè)的“窗口期”，從而大大降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)[3-6]。 目前全國(guó)血站核酸檢測(cè)工作已逐步在各地區(qū)普及[7]，更多的實(shí)驗(yàn)室關(guān)注核酸檢測(cè)的質(zhì)量更加注重核酸檢測(cè)系統(tǒng)性能確認(rèn)工作。 國(guó)際輸血協(xié)會(huì)（International Society Blood Transfusion，ISBT）指出安裝確認(rèn)（IQ）、運(yùn)行確認(rèn)（OQ）、性能確認(rèn)（PQ）是設(shè)備確認(rèn)的3 個(gè)連續(xù)階段,并對(duì)具體操作進(jìn)行了說(shuō)明[8]。 本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)施性能確認(rèn)前對(duì)安裝調(diào)試完畢的浩源核酸系統(tǒng)的設(shè)備已進(jìn)行評(píng)估,確保設(shè)備硬件和軟件的正確安裝,設(shè)備在可要求的范圍內(nèi)正確運(yùn)行。 目前，全自動(dòng)NAT 儀器這樣的大型儀器IQ和OQ 通常由廠商的工程技術(shù)人員進(jìn)行，而PQ 則需實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備使用人員來(lái)完成[9]。

表1 36 份編號(hào)為P 系列樣本背景清單

表2 浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)WHO 標(biāo)準(zhǔn)品分析靈敏度的驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)驗(yàn)證操作性能（通量測(cè)試和壓力測(cè)試）和檢測(cè)性能（靈敏度驗(yàn)證、平行試驗(yàn)、抗交叉污染和檢測(cè)能力）兩個(gè)方面[10]，設(shè)計(jì)確認(rèn)方案完成對(duì)浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)性能的評(píng)估。 通量測(cè)試是實(shí)驗(yàn)室對(duì)浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)量和檢測(cè)時(shí)間有一個(gè)預(yù)估計(jì),14h 內(nèi)可完成1 488 份樣本的8 混檢模式檢測(cè)，為今后日常檢測(cè)合理安排工作提供依據(jù)。 使用浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行8 混檢模式檢測(cè),由于平常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)量較大,在壓力測(cè)試測(cè)評(píng)價(jià)中模擬實(shí)際運(yùn)行過(guò)程中最大的檢測(cè)壓力，并連續(xù)檢測(cè)，以此驗(yàn)證了檢測(cè)系統(tǒng)的滿負(fù)荷運(yùn)行狀況以在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行時(shí)的系統(tǒng)穩(wěn)定性。 靈敏度驗(yàn)證方面，參考ELISA 弱陽(yáng)性質(zhì)控品來(lái)監(jiān)控試驗(yàn)的有效性和穩(wěn)定性[11]，監(jiān)控系統(tǒng)的趨勢(shì)變化。按照規(guī)程要求，結(jié)合NAT 自身特點(diǎn)和靈敏度血清盤結(jié)果, 筆者認(rèn)為選擇最低檢測(cè)限0.5~2 倍檢出限的NAT 標(biāo)準(zhǔn)品作為分析靈敏度驗(yàn)證的陽(yáng)性樣本,其病毒含量明確，一致性較好，相對(duì)于日常檢測(cè)的血液樣本,更適用于新儀器的靈敏度檢測(cè)確認(rèn)。 由表2 可知,分析靈敏度驗(yàn)證HBV DN A、HCV RNA 和HIV RNA-1 95%檢出限為分別為6.00 IU/ml、24.00 IU/ml、48.00 IU/ml， 這與試劑說(shuō)明書(shū)基本相符。 平行試驗(yàn)評(píng)價(jià)采用另外一套系統(tǒng)當(dāng)日檢測(cè)過(guò)的樣本進(jìn)行檢測(cè)， 僅有1 個(gè)pool 混檢陽(yáng)性，經(jīng)拆分后為陰性，并在前一套系統(tǒng)內(nèi)重復(fù)檢測(cè)，均為陰性。 分析原因：可能由于檢測(cè)方案、靈敏度的不同，出現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的差異。由于NAT 防污染是必須重視的1 個(gè)問(wèn)題[12]，實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行抗交叉污染評(píng)價(jià)之前，首先進(jìn)行了防污染監(jiān)控確認(rèn)，確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、設(shè)備無(wú)污染。 其次將陽(yáng)性（含HBV、HCV、HIV 強(qiáng)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性樣本） 和陰性樣本混合交叉排列進(jìn)行交叉污染的評(píng)估,可以有效的驗(yàn)證儀器在匯集、 提取和擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)待測(cè)樣本的處理是否存在交叉污染[13]，便于日后出現(xiàn)多孔位反應(yīng)性時(shí)，排除系統(tǒng)原因，分析污染原因。 系統(tǒng)性能驗(yàn)證血清盤是一組含有陰性、強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性樣本以及常見(jiàn)基因型樣本，通過(guò)混樣檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性、基因型覆蓋面、弱陽(yáng)性樣本的檢測(cè)能力、防交叉污染能力等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)， 其檢測(cè)性能符合實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)要求。

通過(guò)性能確認(rèn),我們對(duì)浩源核酸檢測(cè)系統(tǒng)的綜合性能有了全面的了解,其操作性能和檢測(cè)性能基本符合實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)要求。 同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室日常的檢測(cè)量和檢測(cè)成本,在設(shè)計(jì)核酸檢測(cè)系統(tǒng)的確認(rèn)方案時(shí)，除考慮滿足法律法規(guī)外，還應(yīng)參加NAT室間質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)價(jià)活動(dòng),作為性能確認(rèn)工作的補(bǔ)充，并對(duì)這一系列確認(rèn)活動(dòng)形成確認(rèn)報(bào)告。