超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在維生素檢驗(yàn)中的應(yīng)用

摘要：維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素。目前，其檢驗(yàn)方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，免疫檢驗(yàn)法無(wú)法區(qū)分其亞型及同分異構(gòu)體，因此經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以檢驗(yàn)速度快，分辨率高，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)成為標(biāo)本內(nèi)小分子檢驗(yàn)分析的金標(biāo)準(zhǔn)，快速應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷的多個(gè)方向。為減少標(biāo)本采集量及一次進(jìn)樣同時(shí)檢驗(yàn)多種維生素提供了檢驗(yàn)平臺(tái)。

關(guān)鍵詞：檢驗(yàn)原理;在維生素檢驗(yàn)中的應(yīng)用;局限性

一、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢驗(yàn)原理

經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本進(jìn)入超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)，經(jīng)色譜柱分離、純化和濃縮，被導(dǎo)入質(zhì)譜儀的離子源。標(biāo)本在離子源內(nèi)電離，帶電離子在接口內(nèi)進(jìn)行去溶劑，通過(guò)Q0聚集、冷卻進(jìn)入三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分離。Q1質(zhì)量分析器被設(shè)定為選擇特定的母離子，母離子在Q2碰撞室碎化、裂解，產(chǎn)生的子離子進(jìn)入Q3質(zhì)量分析器進(jìn)行分離。檢驗(yàn)器記錄離子的信號(hào)，然后將信號(hào)傳輸?shù)诫娔X繪制成圖譜。以穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)來(lái)校準(zhǔn)和消除測(cè)量誤差，將標(biāo)本與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算血清標(biāo)本中對(duì)應(yīng)維生素含量。具體如下：

二、在維生素檢驗(yàn)中的應(yīng)用

維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素。其中，脂溶性維生素包括維生素A、25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3、維生素E、維生素K;水溶性維生素包括維生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12以及維生素C。維生素是人體所必需的微量營(yíng)養(yǎng)成分，是機(jī)體酶系統(tǒng)中輔酶的重要組成部分，對(duì)新陳代謝起調(diào)節(jié)作用。一般在體內(nèi)不能合成或合成量很少，需通過(guò)飲食等手段獲得。維生素缺乏或過(guò)量均會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)性疾病的發(fā)生，故提高維生素檢驗(yàn)準(zhǔn)確性、特異性是滿(mǎn)足臨床檢驗(yàn)診斷需求的必然。

不同維生素具有不同的分子式，化學(xué)性質(zhì)也不盡相同，即使相同維生素，也有不同的分子結(jié)構(gòu)。維生素檢驗(yàn)從標(biāo)本預(yù)處理到準(zhǔn)確檢驗(yàn)應(yīng)用方法都存在著不同的技術(shù)挑戰(zhàn)。例如酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光法無(wú)法區(qū)分維生素亞型及同分異構(gòu)體，易與自身內(nèi)抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性較低，因此經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。而且不同檢驗(yàn)品牌試劑對(duì)不同目標(biāo)免疫化合物的免疫捕獲率也會(huì)存在一定差異，不同檢驗(yàn)平臺(tái)的免疫檢驗(yàn)方法結(jié)果可比性較差。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以檢驗(yàn)速度快，分辨率高，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)成為標(biāo)本內(nèi)小分子檢驗(yàn)分析的金標(biāo)準(zhǔn)，快速應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷的多個(gè)方向，逐漸被臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專(zhuān)家們所廣泛關(guān)注。在歐美國(guó)家，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)行業(yè)協(xié)會(huì)公認(rèn)的生物標(biāo)本內(nèi)小分子分析的金標(biāo)準(zhǔn)方法，已被其權(quán)威檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用于臨床研究及診斷。

以維生素D檢驗(yàn)為例，人體維生素D主要來(lái)源于經(jīng)陽(yáng)光和皮膚作用合成的維生素D3，另一種來(lái)源是食物中的維生素D2，兩者均需要在肝臟中單羥基化為25-羥基維生素D3（25-OHD3）和25-羥基維生素D2（25-OHD2），然后再經(jīng)過(guò)腎臟兩次羥基化才能轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘奈⒘侩p羥基代謝產(chǎn)物1，25-（OH）2D，其中25-OHD2和25-OHD3是人體血清中25-羥基維生素D（25-OHD）主要的存在形式。同時(shí)人體中還存在25-OHD3的異構(gòu)體，但目前傳統(tǒng)的免疫檢驗(yàn)方法無(wú)法區(qū)分亞型維生素D2、D3及異構(gòu)體。因此，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)于醫(yī)生干預(yù)補(bǔ)充維生素D2的人群，嬰幼兒及腎功能異常的患者具有重要意義，還可用于評(píng)價(jià)免疫法的交叉反應(yīng)程度。此外，由于維生素具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，免疫方法學(xué)需要不同的抗體及方法，而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是分子水平的檢驗(yàn)，可以一次進(jìn)樣同時(shí)檢驗(yàn)多種維生素及其相關(guān)活性代謝產(chǎn)物。

一次標(biāo)本處理且檢驗(yàn)多種維生素的難點(diǎn)在于各待測(cè)物在人體血清中的含量差別較大，如人體血清中維生素A、E的含量較高而維生素K的含量微乎其微，且各維生素的極性差別較大，傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法很難同時(shí)滿(mǎn)足對(duì)維生素在線(xiàn)性范圍內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)并滿(mǎn)足其高靈敏度的要求。此外，不同人體血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)維生素檢驗(yàn)還存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)。先進(jìn)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢驗(yàn)多種維生素的需求，其優(yōu)勢(shì)在于：預(yù)處理方法采用96孔板方法，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟、大大縮短了預(yù)處理時(shí)間，提高了檢驗(yàn)通量;采用梯度洗脫，在縮短分析時(shí)間的同時(shí)獲得了較好的去介質(zhì)及分離效果，一次進(jìn)樣可同時(shí)得到多種維生素檢驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)在預(yù)處理過(guò)程中添加內(nèi)標(biāo)以消除不同基質(zhì)標(biāo)本中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待檢物的影響，進(jìn)而提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

三、局限性

專(zhuān)業(yè)人才培養(yǎng)是臨床實(shí)驗(yàn)室迎接超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗(yàn)時(shí)代來(lái)臨的基礎(chǔ)。不同于臨床常規(guī)檢測(cè).超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)業(yè)人才需經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培訓(xùn)、臨床實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)積累，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在引入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)前充分重視專(zhuān)業(yè)人員的培養(yǎng)工作。目前，國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室缺乏大量有經(jīng)驗(yàn)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)專(zhuān)業(yè)人才，這嚴(yán)重制約了質(zhì)譜技術(shù)快速轉(zhuǎn)化至臨床實(shí)踐。

我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)質(zhì)譜檢驗(yàn)新項(xiàng)目建立和方法性能評(píng)價(jià)的經(jīng)驗(yàn)相對(duì)不足，大多參照國(guó)外文獻(xiàn)和少部分國(guó)內(nèi)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)建立、性能評(píng)價(jià)、設(shè)立評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理。這種自我管理模式為內(nèi)部質(zhì)量管理和外部標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，因此亟待我國(guó)相關(guān)部門(mén)出臺(tái)針對(duì)質(zhì)譜相關(guān)的臨床實(shí)踐指南以規(guī)范質(zhì)譜臨床檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)不同臨床實(shí)驗(yàn)室間技術(shù)水平與能力參差不齊，人員素質(zhì)和檢驗(yàn)系統(tǒng)存在一定差異，若放松對(duì)質(zhì)譜技術(shù)臨床應(yīng)用的監(jiān)督和管理，任其恣意發(fā)展，最終帶來(lái)的只能是“亂象”，而直接參照美國(guó)FDA的監(jiān)管，則將可能極大阻礙我國(guó)質(zhì)譜技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域的發(fā)展。對(duì)于我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)狀而言，質(zhì)譜技術(shù)臨床應(yīng)用的發(fā)展需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)重于監(jiān)管需求。如何滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的臨床需求，鼓勵(lì)質(zhì)譜技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室中得到科學(xué)普及和規(guī)范應(yīng)用則是我們需要考慮的問(wèn)題。

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作者簡(jiǎn)介：

尚麗麗，女，漢族，醫(yī)學(xué)學(xué)士（醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)），13年臨床實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)，主要從事生殖遺傳，優(yōu)生優(yōu)育，亞健康評(píng)估等方向的檢驗(yàn)研究工作。