摘要：果蠅是一種常見的模式生物，在胚胎發(fā)育、疾病的發(fā)病機制以及基因表達調(diào)控等研究中發(fā)揮極其重要的作用。果蠅應激反應最主要涉及的是 JNK 信號通路，是一種真核生物進化保守的信號通路。因此研究JNK信號通路中各基因的作用至關重要。本次實驗主要目的是將果蠅JNK信號通路中的egr基因進行過表達，觀察其對果蠅的影響。本文將對本次實驗中egr基因過表達的pUAST載體構建做一個詳細說明。

關鍵詞：egr基因;分子克隆;載體構建

果蠅應激反應最主要涉及的是JNK信號通路，該通路是指一種由一系列內(nèi)在和外在的應激源所誘發(fā)的應激活化蛋白激酶途徑，是一種真核生物進化保守的信號通路，調(diào)控廣泛的細胞過程如細胞凋亡等。[1]egr是果蠅中TNF唯一的同源物，啟動TNF-JNK通路誘導細胞死亡。[2]本次實驗目的是構建果蠅egr基因的過表達質粒，并將其導入果蠅體內(nèi)并使其表達，觀察egr基因過表達對細胞凋亡的影響。

一、基因序列和pUAST載體信息

（一） egr基因序列

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇gene，輸入egr選擇物種為果蠅，查看genbank序列，得到egr基因的兩個變體isoform A和isoform B，使用較長的isoform A來進行引物設計。

（二）pUAST質粒信息

下圖為pUAST序列信息，我們可以詳細看到質粒載體的多克隆位點及其序列。

二、PCR引物設計

引物設計是用一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成。

引物設計過程中有以下注意要點：

（一）引物長度一般為15—30bp，其有效長度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否則會降低產(chǎn)物的特異性。

（二）G十C含量應在40%一60%之間，PCR擴增中的復性溫度一般較Tm值低等于引物的Tm值減去5—10度。

（三）堿基分布盡量保證隨機性，應避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，尤其是不應在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

（四）引物不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結構。

（五）兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。

（六）一個引物的3‘末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。

（七）引物應當超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸，起到保護作用。

本次引物設計使用的軟件為primer premier 5.0。通過egr基因CDS序列與pUAST的多克隆位點進行比對，確定限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，保證在酶切時不破壞egr基因的編碼區(qū)。

三、PCR反應

PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，DNA雙鏈解離成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;2、模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;3、引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對原則合成一條新的互補鏈;4、重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。[4]

實驗中先將果蠅的總RNA提取出來，然后進行反轉錄得到cDNA。在PCR反應體系中依次加入以下試劑：10 x PCR buffer 2.5μl，dNTP 2μl，cDNA 2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA Polymerase 0.5μl（必須選用高保真的DNA聚合酶），ddH2O 16μl。經(jīng)過變性、退火、延伸步驟后，得到擴增的DNA序列。制作1%瓊脂糖凝膠，用PCR產(chǎn)物進行電泳，電泳后進行切膠回收。

四、目的基因插入載體

先將PCR擴增得到的egr基因和pUAST質粒進行雙酶切，然后進行電泳來分離酶切后的線性質粒和未被酶切的質粒，通過凝膠純化來純化回收。使用DNA連接酶將帶有粘末端的egr基因和線性質粒連接，得到egr-pUAST質粒。注意最好使連接片段與載體的比為3：1，以保證只有少量的載體發(fā)生自連，提高載體構建的效率。然后將egr-pUAST質粒導入感受態(tài)的大腸桿菌進行復制轉化，將轉化后的大腸桿菌涂至含抗生素的瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過夜。成功轉化的大腸桿菌可以在瓊脂板上形成菌落，挑取多個單克隆菌落接種到含培養(yǎng)液的管中，在搖床培養(yǎng)箱中擴增。擴增后的少量培養(yǎng)物在編號的瓊脂板上涂板，其余用于質粒純化后用限制性核酸內(nèi)切酶進行切割，將切割后的產(chǎn)物進行凝膠電泳來確定大腸桿菌轉化的使含插入片段的質粒而非自連的質粒。將確定含插入片段質粒的大腸桿菌進一步擴大培養(yǎng)，然后將質粒純化。最后將所得的片段進行測序，驗證目的基因得到了克隆，然后保種。[3]

五、總結

本次實驗將用到分子克隆這一技術，將egr基因插入到pUAST質粒后導入果蠅中，讓egr基因在果蠅中進行過表達，觀察egr基因過表達后對果蠅產(chǎn)生的影響。總結目前所做的工作可以發(fā)現(xiàn)，引物設計是該實驗中最困難、也是最容易出現(xiàn)問題的地方。另外，酶切位點的尋找和選擇也是一項技術性工作。在今后的實驗中要加強對相關內(nèi)容的學習和操作，以便能成功學好分子克隆這項技術。

參考文獻：

[1]唐成晨，賈佳.果蠅JNK信號通路的研究進展[J].生物學雜志，2019，36（03）：78-82.

[2]薛奮勤，許晴，魏華， 等.僅采用 PCR 進行分子克隆的方法探索[J].首都醫(yī)科大學學報，2014，

作者簡介：

唐鵬程 王繼善 王永賽，臨沂大學。