吳一堔　曹華陽 李亞彤 劉佐萱 劉蘭濤

摘要 目的：探討直腸癌中FOXP3+Treg細(xì)胞的比例變化，揭示輔助性T細(xì)胞在直腸癌中的作用。方法：收集臨床標(biāo)本，用流式細(xì)胞儀檢測直腸癌組織、癌旁組織和正常組織的比例。結(jié)果：癌組織中輔助性T細(xì)胞的比例31.6%，較癌旁組織17.8%明顯增高。結(jié)論： FOXP3+Treg 細(xì)胞直腸癌組織中高表達(dá)，直腸癌的發(fā)生和發(fā)展有重要關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 直腸癌;輔助性T細(xì)胞;腫瘤轉(zhuǎn)移

在我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率位居腫瘤第五。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展受到腫瘤缺氧微環(huán)境的調(diào)控，免疫耐受和免疫逃逸在其中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道指出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過抑制有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答而促進(jìn)多種癌癥的惡性進(jìn)展。在癌癥病人的腫瘤微環(huán)境中會浸潤大量輔助性T細(xì)胞，系統(tǒng)性敲除機(jī)體FOXP3+Treg細(xì)胞會增強(qiáng)自身效應(yīng)性T細(xì)胞的活化及功能和固有性免疫應(yīng)答。

材料和方法

1.1收集臨床標(biāo)本：收集直腸癌確診病例標(biāo)本，年齡18歲以上，經(jīng)病理診斷直腸癌的，手術(shù)過程中收集癌組織和癌旁組織新鮮標(biāo)本，提取單個(gè)核細(xì)胞，用于facs檢測。IL-10、CTLA-4、CD4+等抗體均購于 eBioscience。

1.2 流式細(xì)胞檢測：采用密度梯度離心法富集淋巴細(xì)胞，流式分析其中FOXP3+Treg 細(xì)胞比例及其分泌的抑制性細(xì)胞因子CTLA-4 的變化。取調(diào)整好的細(xì)胞懸液 100微升 ，按試劑盒說明操作，加入一抗，二抗，用1%的多聚甲醛300μl重懸固定，24小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用 SPSS 25. 0分析數(shù)據(jù)，以 均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)量。成對組間比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析 （ ANOVA） 檢驗(yàn)，P? < 0. 05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1直腸癌與癌旁組織中 FOXP3+Treg 細(xì)胞比例變化

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示FOXP3+Treg 細(xì)胞在大腸癌組織中高表達(dá)，癌組織中FOXP3+Treg 細(xì)胞的比例為36.1%，明顯高于癌旁組織中FOXP3+Treg 細(xì)胞比例18.7%和正常對照組織中的FOXP3+Treg 細(xì)胞比例

2.2FACS 分析 FOXP3+Treg 細(xì)胞內(nèi)抑制性受體 CTLA-4 的表達(dá)情況

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示癌組織內(nèi)FOXP3+Treg細(xì)胞內(nèi)CTLA-4受體 大腸癌組織中表達(dá)明顯增高，癌組織中FOXP3+Treg 細(xì)胞內(nèi)CTLA-4受體比例為54.5%，明顯高于癌旁組織中FOXP3+Treg 細(xì)胞內(nèi)CTLA-4比例16.8%。

討論

本課題研究直腸癌發(fā)現(xiàn)，與正常組織、癌旁組織相比，癌組織中輔助性FOXP3+Treg細(xì)胞比例顯著上調(diào) 。這與其他學(xué)者研究的非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌組織中較癌旁組織FOXP3+Treg浸潤程度明顯增高的結(jié)論一致，提示輔助性FOXP3+Treg細(xì)胞在結(jié)直腸癌抗腫瘤免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。

Koch等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3+Treg細(xì)胞中的一個(gè)亞群可以表達(dá)Th1其趨化因子受體CXCR3和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet。大多數(shù)CXCR3+T-bet+FOXP3+Treg可更高水平的表達(dá)免疫抑制性受體CTLA-4和抑制性細(xì)胞因子IL-10。FOXP3+Treg細(xì)胞的高表達(dá)對由Th1介導(dǎo)的I型免疫反應(yīng)中FOXP3+Treg的穩(wěn)態(tài)和遷移能力也起到至關(guān)重要的作用，如T-bet+FOXP3+Treg細(xì)胞可聚集并調(diào)控由Th1介導(dǎo)的I型炎癥反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可通過抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用而提高自身的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境可明顯上調(diào)免疫抑制性受體CTLA4的表達(dá)，有可能是由于FOXP3+Treg細(xì)胞內(nèi)T-bet的蛋白水平上調(diào)引起的，此外，由此我們分析結(jié)直腸癌的缺氧微環(huán)境參與調(diào)控T-bet+Treg細(xì)胞比例及其免疫抑制功能。

然而腫瘤微環(huán)境是如何引起FOXP3+Treg 細(xì)胞比例上調(diào)的現(xiàn)在還不是特別清楚。?Yuan 等在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，DNA 損傷會引起USP10 蛋白入核增多，可使得P53 蛋白去泛素化增多，達(dá)到穩(wěn)定P53 的功能。我們猜測缺氧是否也會引起USP10 的入核增多，從而穩(wěn)定T-bet 。我們根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)猜測腫瘤微環(huán)境引起 FOXPTreg 細(xì)胞內(nèi) T-bet 的基因的水平變化，引起 USP10 表達(dá)上調(diào)，我們認(rèn)為直腸癌缺氧的微環(huán)境可使 USP10 入核增多并穩(wěn)定引起 T-bet 蛋白，從而上調(diào) T-betFOXP3Treg 細(xì)胞比例。缺氧誘導(dǎo)因子（ HIFs）在細(xì)胞缺氧時(shí)維持胞內(nèi)氧平衡并促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境而存活。在缺氧環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞主要通過 HIFs 激活一系列適應(yīng)性基因來保證自身存活，HIF1α 和 HIF2α 在其中發(fā)揮重要作用。

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