成思軒, 龍文聰, 楊瑤君, 肖析蒙*

1. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610000；

2. 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，四川 樂山 614000

2020-01-06 收稿, 2020-06-22 網(wǎng)絡(luò)版發(fā)表

紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）菊科澤蘭屬多年生草本或成半灌木狀植物。原產(chǎn)地為墨西哥，主要分布于中國、美國、澳大利亞、新西蘭等地。1960年至今，紫莖澤蘭主要分布從云南省南部地區(qū)，蔓延至我國四川、貴州、西藏廣西等多個省份地區(qū)，遍布高達(dá)11平方公里，已經(jīng)嚴(yán)重影響到農(nóng)業(yè)和林業(yè)的生產(chǎn)。為將紫莖澤蘭變廢為寶，研究方向已逐步從防治轉(zhuǎn)向利用[1,2]。目前對于紫莖澤蘭的研究有多個方面：紫莖澤蘭的入侵基質(zhì)與防治技術(shù)[3]、紫莖澤蘭化感作用[4]、紫莖澤蘭對生態(tài)的破壞作用[5]、紫莖澤蘭入侵對土壤微生物的影響[6]及紫莖澤蘭相關(guān)資源綜合利用等多個方面[7]，有研究通過從紫莖澤蘭內(nèi)提取出能夠?qū)︱x、蚜蟲等林業(yè)害蟲有致死效果的提取物，應(yīng)用于林業(yè)害蟲防治的方面[8][9]。對紫莖澤蘭的防治常通過噴灑除草劑和人工收割的方式進(jìn)行處理，而收割下來的紫莖澤蘭能夠作為有機(jī)肥底物進(jìn)行再利用[10]，也有通過加工處理后作為飼料[11]或者作為木糖醇的發(fā)酵底物[12]。

然而紫莖澤蘭對與植物幼苗[13]以及動物都有著一定的毒性，需要通過相應(yīng)脫毒處理或者發(fā)酵過后才能夠加以應(yīng)用[14,15]。將紫莖澤蘭直接用于微生物培養(yǎng)基方面能夠減少紫莖澤蘭的加工步驟，培養(yǎng)基內(nèi)的剩余殘渣還可加工成肥料的產(chǎn)品回收利用，是一種新型的紫莖澤蘭資源利用的方法。將紫莖澤蘭應(yīng)用于微生物繁殖方面能夠快速的提高發(fā)酵罐內(nèi)微生物數(shù)量，但因紫莖澤蘭有著多種揮發(fā)性物質(zhì)，會對發(fā)酵類產(chǎn)品品質(zhì)造成影響[16]，所以不適合應(yīng)用于食品類微生物上，但更加適合應(yīng)用于微生物菌肥、沼氣生產(chǎn)用微生物等工程類微生物的快速繁殖上有著較好的應(yīng)用前景。有研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭入侵后顯著改變土壤內(nèi)微生物群落，其入侵區(qū)域土壤內(nèi)的固氮菌數(shù)量是未入侵區(qū)域的8倍以上[17]，進(jìn)而提升周邊土壤內(nèi)的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀的含量，提升紫莖澤蘭的繁殖速度[18]，表明紫莖澤蘭能夠促進(jìn)微生物的繁殖。為了探索紫莖澤蘭是否能夠?qū)莶菅挎邨U菌的繁殖起到促進(jìn)作用，本文嘗試向培養(yǎng)基內(nèi)增加紫莖澤蘭粉末探索微生物繁殖的動態(tài)變化，為紫莖澤蘭資源的利用提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗材料：枯草芽孢桿菌（竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、氯化鈉、酵母提取物、蛋白胨（成都市科龍化工試劑廠）；

紫莖澤蘭干粉：取自四川省樂山市犍為縣道路邊坡，60 ℃烘干24 h，將其根莖、枝條葉片打磨成粉過40目篩網(wǎng)后收集粉末備用。

1.2 試驗處理與方法

菌落計數(shù)培養(yǎng)基使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：稱取37.0 gPDA干粉，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解后，放置于121 ℃高壓滅菌15 min，傾倒與已滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)備用。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入950 mL蒸餾水后用5 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

菌液準(zhǔn)備：將枯草芽孢桿菌接種在液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，當(dāng)菌液內(nèi)菌落數(shù)量達(dá)到10-6時，放于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 研究方法

1.3.1 不同部位對枯草芽孢桿菌生長的影響

實驗分為4個組，LB培養(yǎng)基作為對照組CK，培養(yǎng)基A、B、C組在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加紫莖澤蘭不同部位粉末（見表1），每個組設(shè)置3個重復(fù)，121 ℃高壓滅菌15 min。每組液體培養(yǎng)基滅菌后加入1 mL枯草芽孢桿菌菌液，放置在30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)，在接種后每隔24 h統(tǒng)計1次培養(yǎng)液內(nèi)枯草芽孢桿菌數(shù)量，持續(xù)5 d。

采用平板涂布法統(tǒng)計枯草芽孢桿菌數(shù)量：吸取1 mL培養(yǎng)基內(nèi)液體到刻度試管內(nèi)1，加入9 mL無菌水此時稀釋倍數(shù)為10倍，吸取試管1內(nèi)菌液1 mL至試管2內(nèi)記為10-2，加入9 mL無菌水，依次類推至試管內(nèi)菌液稀釋濃度為10-9；依次吸取試管1～10內(nèi)的菌液0.5 mL在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）內(nèi)，涂布均勻每個濃度4個重復(fù)，放置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；選擇菌落數(shù)于30～300之間的培養(yǎng)基，用Microsoft Excel軟件統(tǒng)計微生物數(shù)量。

表1 培養(yǎng)基成分表Tab.1 Composition of the culture medium

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭根系粉末

通過添加紫莖澤蘭根系粉末后，微生物數(shù)量有著明顯提升。根系粉末添加組A3內(nèi)枯草芽孢桿菌數(shù)量在第3天達(dá)到最高值91×106CFU·mL-1，而CK組在第四天才達(dá)到最大濃度 46×106CFU·mL-1（見表2）；微生物數(shù)量隨著根系粉末添加量增加而增加，A2和A3組在第3天達(dá)到最大值，A2組在第2天增長速度達(dá)到最高139.39%，之后出現(xiàn)不同程度的下降，下降速率最快的為A3組，第5天下降數(shù)值達(dá)到49.25%（見表3）。

表2 A 組有效活菌數(shù)統(tǒng)計Tab.2 Statistics of effective viable bacteria in group A單位：（×106 CFU·mL-1）

2.2 紫莖澤蘭莖部粉末

添加有紫莖澤蘭莖部粉末的培養(yǎng)基內(nèi)，微生物數(shù)量有一定程度的提升，微生物數(shù)量增加最多為B3 組達(dá) 52×106CFU·mL-1（見表 4），高出對照組13.04%，微生物增長速度最高的為B2組，在第3天增長率達(dá)到100%；對于微生物衰減速率而言，試驗組B1、B2微生物在第三天達(dá)到最大值，B3則是第四天；之后出現(xiàn)不同程度的下降，其中最明顯的為B1組減少速率最高達(dá)到44.74%，但減少速率仍比試驗組低16.07%（見表5）。

表3 A 組枯草芽孢桿菌增長比例Tab.3 Growth rate of Bacillus subtilis in group A單位：%

表4 B 組有效活菌數(shù)統(tǒng)計表Tab.4 Statistics of effective viable bacteriain group B單位：（×106 CFU·mL-1）

表5 B 組枯草芽孢桿菌增長比例Tab.5 Growth rate of Bacillus subtilis in group B單位：%

2.3 紫莖澤蘭莖部粉末

紫莖澤蘭葉片粉末對微生物的促生效果相比于根、莖粉末的效果較低，但仍有促進(jìn)微生物繁殖的作用，C2組微生物數(shù)量最大值比對照組少15.21%，C3在第3天達(dá)到最大值51×106CFU·mL-1（見表6），比對照組高出10.87%；C組中微生物增長率在1到3天均高于對照組，最高增加率為C3組96.15%，在第4天開始出現(xiàn)微生物數(shù)量衰減，C2、C3組則是第三天，最高減少量為35.9%（見表7）。

3 結(jié)論與討論

添加有紫莖澤蘭根、莖、葉干粉的培養(yǎng)基內(nèi)微生物數(shù)量都有不同程度的提升，紫莖澤蘭根莖干粉能夠更有效地提升枯草芽孢桿菌在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)的繁殖速度，特別是在接種菌種的48 h之內(nèi)，添加有紫莖澤蘭根莖粉末的培養(yǎng)基內(nèi)微生物的繁殖速度高出對照組54.78%，最高數(shù)量為對照組的1.9倍。紫莖澤蘭根干粉不同用量對枯草芽孢桿菌繁殖促進(jìn)效果不一樣，在1～3 d內(nèi)，0.5 g·L-1根干粉用量促進(jìn)效果不如 1 g·L-1和 1.5 g·L-1，1 g·L-1和 1.5 g·L-1根干粉用量促進(jìn)效果相近；3～5 d內(nèi)1.5 g·L-1根干粉用量促進(jìn)效果不如1 g·L-1根干粉用量促進(jìn)效果，但都比對照組促進(jìn)效果好，關(guān)于根干粉不同用量如何對枯草芽孢桿菌繁殖促進(jìn)作用有待進(jìn)一步研究。莖、葉的干粉不同用量對枯草芽孢桿菌繁殖促進(jìn)效果相近，其作用時間對枯草芽孢桿菌繁殖效果也相差不大。培養(yǎng)基內(nèi)微生物快速生長，對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗則會增加，如果未能及時補(bǔ)充培養(yǎng)液中的養(yǎng)料物質(zhì)，培養(yǎng)液內(nèi)微生物繁殖速度則會逐漸衰減甚至出現(xiàn)逆增長的情況[19]。這也是試驗組中添加有紫荊澤蘭粉末的培養(yǎng)基更快出現(xiàn)微生物繁殖逆增長的原因，但是試驗組中微生物衰減的速度相比對照組更加緩慢，推測是因為培養(yǎng)基內(nèi)的紫莖澤蘭粉末被微生物緩慢分解，提供了部分養(yǎng)料，減緩了培養(yǎng)基內(nèi)微生物衰亡的速度。

表6 C 組有效活菌數(shù)統(tǒng)計表Tab.6 Statistics of effective viable bacteriain group C單位：（×106 CFU·mL-1）

表7 C 組枯草芽孢桿菌增長比例Tab.7 Growth rate of Bacillus subtilis in group C單位：%

本實驗并未對微生物發(fā)酵液內(nèi)物質(zhì)的變化進(jìn)行檢測分析，在未來將會對培養(yǎng)接內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)的動態(tài)監(jiān)測分析，進(jìn)一步了解紫莖澤蘭對微生物促生的機(jī)理，并和其他外來入侵植物對微生物生長的促進(jìn)效果進(jìn)行對比，尋找效果更加的微生物發(fā)酵添加物。