馬肖肖 趙利

1、江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

2、國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國四大淡水家魚之一，其肉質(zhì)肥嫩、味鮮美，深受消費(fèi)者喜愛，是一種營養(yǎng)價值較高的水產(chǎn)品。酒糟魚是江西鄱陽湖地區(qū)的特色美食，產(chǎn)品選用活鮮草魚，以精釀酒糟糟制，通過糟制可使魚糟之間蛋白相互補(bǔ)進(jìn)，魚肉的營養(yǎng)成分發(fā)生變化，經(jīng)過微生物的作用鮮味氨基酸含量增加，各項(xiàng)指標(biāo)均高于WHO/FAO 提出的參考蛋白模式標(biāo)準(zhǔn)[1]。有研究表明，微生物在酒糟魚糟制過程中發(fā)揮著極為重要的作用，影響著酒糟魚風(fēng)味物質(zhì)的變化和形成。將傳統(tǒng)分離方法與16S rRNA 分子鑒定技術(shù)相結(jié)合，對酒糟魚糟制過程中微生物進(jìn)行分析得出酒糟魚的主要優(yōu)勢菌為乳酸桿菌和明串珠菌，但由于傳統(tǒng)分離條件限制無法進(jìn)行全面分析[2]。同時不同的糟制方式使酒糟魚產(chǎn)生了不同的風(fēng)味物質(zhì)，其微生物群落結(jié)構(gòu)也將隨之發(fā)生變化。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其無須進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，不僅可以檢出樣品中微生物的菌種組成，還能確定其相對豐度[3]。因此，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、食品微生物檢測等多方面[4-5]。

為了全面地研究酒糟魚產(chǎn)品所含微生物種類情況，本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自制酒糟魚和市場酒糟魚為研究對象，采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)分析兩種不同酒糟魚樣品中的菌群組成情況及優(yōu)勢菌種，分析其群落豐度和差異，為酒糟魚發(fā)酵過程中微生物的影響作用提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：酒糟魚（200～250 g）。工廠直取腌制魚塊標(biāo)號為A，以A 做發(fā)酵處理自制酒糟魚標(biāo)號為B，以A 做發(fā)酵處理工廠制作酒糟魚標(biāo)號為C，三種魚均于同一時間段做處理。

試劑：實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑和耗材如表1 所示。

表1 主要試劑/ 耗材

1.2 儀器設(shè)備

表2 主要儀器設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

使用高溫滅菌的剪刀或刀片將樣品剪碎后混合均勻，取適量樣品（不超過0.5 g）放入2 ml 樣品管，在組織破碎儀中進(jìn)行破碎后提取。

1.3.2 DNA 提取方法

按照Omega 公司細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒的方法操作，以O(shè)MEGA 試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒提取樣品總DNA，瓊脂糖凝膠檢測DNA 完整性，Qubit 定量檢測DNA 樣本濃度[6]。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增

利用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量，確定加入的DNA 量，以提取的總細(xì)菌基因組DNA 為模板，引物針對16S rRNA 基因V3/V4 區(qū)，利用341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)純化后的樣品進(jìn)行定量檢測[7]。將檢測后的樣品委托上海生工生物工程股份有限公司，進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)優(yōu)化處理

Illumina MiseqtTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA 堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，由于Miseq 測序序列中含有barcode 序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對的reads 拼接（merge）成一條序列，然后按照barcode 標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)[8]。

基于操作分類單元（OTU）聚類分析結(jié)果，選擇豐度最高的序列作為OTU 的代表性序列，進(jìn)行各類的OTU 分析，通過Alpha 多樣性分析微生物群落的豐度和多樣性，繪制物種分類條形圖和物種豐度熱圖[19]。最后，基于物種分類結(jié)果，比較樣本菌種豐度存在顯著差異的物種分類，篩選條件為P≤0.05，綜合討論酒糟魚發(fā)酵產(chǎn)品中微生物群落的分布差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與OUT 分析

2.1.1 原始序列數(shù)據(jù)

圖1 為原始序列使用pear 融合后的序列長度及該長度reads數(shù)目；圖2 為質(zhì)控（去除barcode、primer 以及部分低質(zhì)量序列）后序列長度及該長度reads 數(shù)目。原始序列共163831 條有效序列，序列平均長度為453.40～465.52 bp，主要集中在461～480 bp 的區(qū)間長度內(nèi)（圖1）。QC 后的序列共160522 條有效序列，平均長度為414.92～427.81，主要集中在425～435 bp 的區(qū)間長度內(nèi)。

圖1 原始序列長度分布圖

圖2 質(zhì)控后序列長度分布圖

2.1.2 OUT 分析

OTU 樣本分布韋恩圖如圖3 所示，不同顏色代表不同組，數(shù)字代表特異或共有的OTU 數(shù)。其中，B、C 兩組的OUT 數(shù)量高于A 組，即發(fā)酵后的酒糟魚產(chǎn)品樣品中的微生物種類在不斷增加；C 組OTU 數(shù)量高于B 組，說明市場酒糟魚產(chǎn)品微生物數(shù)目略高于實(shí)驗(yàn)室自制酒糟魚產(chǎn)品。三種產(chǎn)品的共有OTU 數(shù)目為77 個，這部分微生物保留在了發(fā)酵末期，是對酒糟魚發(fā)酵益處較小的微生物；A、B 共有的66 個和A、C 共有的50 個OTU 數(shù)目則是由于酒糟魚發(fā)酵方式不同導(dǎo)致的改變；B、C 兩組發(fā)酵酒糟魚共有OTU 數(shù)目為73，這些微生物對酒糟魚發(fā)酵益處較大。

圖3 OTU 樣本分布韋恩圖

2.2 Alpha 多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU 信息，采用Alpha 多樣性指標(biāo)的Shannon、Simpson、ACE、Chao1 及Coverage 指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評估，結(jié)果如表3 所示。A 組樣品的ACE、Chao1、Shannon 指數(shù)均高于其他組，Simpson 指數(shù)均低于其他組，說明酒糟魚原樣群落分布豐度高于成品，證明了腌制后酒糟魚菌群分布豐度高于酒糟魚產(chǎn)品；但其菌群落分布多樣性較低，證明了糟制可以有效提高微生物多樣性如B 組的ACE、Chao1、Simpson 指數(shù)低于C 組，Shannon 指數(shù)大于C 組，說明實(shí)驗(yàn)室自制酒糟魚菌群落分布豐度低于市場酒糟魚，群落多樣性大于市場酒糟魚，多樣性的菌種可以促進(jìn)糟制過程中微生物作用的發(fā)揮。

表3 Alpha 多樣性分析表

圖4 所示的稀疏曲線圖中，以橫坐標(biāo)為隨機(jī)取樣抽取到的序列數(shù)，縱軸為其所代表的OTU 數(shù)目構(gòu)建的稀釋曲線反映了樣品的豐富度和測序合理性。以shannon 曲線為例，A、B、C 三條曲線均在序列數(shù)20000 左右時趨于平穩(wěn)，足以證明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會加入少量的OTU 數(shù)目。圖5 所示的Rank-Abundance 曲線以O(shè)TU 等級為橫坐標(biāo)，以每個OTU 中所含的序列數(shù)的相對百分含量為縱坐標(biāo)做圖，反應(yīng)了樣品的豐富程度和均勻程度。由圖可看出，A 組曲線較B、C 兩組平坦，說明腌制魚肉物種組成的均勻程度高于發(fā)酵酒糟魚兩組；而作為發(fā)酵酒糟魚的B、C 兩組物種組成均勻程度較為相似，貼近樣品總體。

圖4 Alpha 指數(shù)稀疏曲線圖

圖5 Rank_Abundance 曲線圖

2.3 不同酒糟魚細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基于屬水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

三種酒糟魚樣本序列經(jīng)分類分析，在屬水平上，其相對豐度排行前50 的菌群柱狀分布圖如圖6 所示，豐度較少統(tǒng)一作other，圖中橫軸為各樣品的編號，縱軸為相對豐度比例，在屬水平上，酒糟魚產(chǎn)品共分離得到了434 屬。

A 組腌制魚肉中魏斯氏菌屬（Weissella）所占的比例較大，余下依次為不動細(xì)菌屬（Acinetobacter） 和假單胞菌屬（Pseudomonas）。研究表明，肉制品中的魏斯氏菌能夠發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、麥芽糖等產(chǎn)生D 乳酸或DL- 乳酸。B 組酒糟魚總細(xì)菌組成主要以乳酸桿菌屬（Lactobacillus） 為主，相對豐度37.03%，余下為布丘氏菌屬（Buttiauxella）、小球菌屬（Pediococcus）、弧菌屬（Vibrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鹽水弧菌屬（Salinivibrio）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。C 組酒糟魚總細(xì)菌組成同樣以乳酸桿菌屬為主，相對豐度50.81%，余下為魏斯氏菌屬（Weissella）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、 嗜 凍 菌 屬（Peptoniphilus）、 漫 游 球 菌 屬（Vagococcus）、葡萄球菌屬、鹽水弧菌屬、狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、 梭 菌 屬 （Fusobacterium）、 消 化 鏈 球 菌（Peptostreptococcus）、摩根氏菌屬（Morganella）和其他屬類。總體來看，發(fā)酵產(chǎn)生了更多菌種，且在豐度大于1%的菌種中，B 組少于C 組；在B、C 兩組中，乳酸桿菌屬可發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)生大量乳酸，是動物和人腸道等處重要的生理性菌群之一，同時也是常用的工業(yè)微生物菌種；小球菌屬中的乳酸小球菌（P.acidilactici）為同型發(fā)酵性乳酸細(xì)菌。

2.3.2 物種豐度熱圖

圖7 菌屬水平所有樣本物種豐度熱圖

將樣品以及菌群落分布信息進(jìn)行聚類并重新排布，將聚類之后的結(jié)果顯示在heatmap 中，可以很好地反映各分類水平上群落分布組成的異同。圖7 所示的物種豐度熱圖為豐度最高的前50 個物種分類信息。由圖中可以看出，B、C 兩組在圖上方聚類樹中的位置靠近，說明兩組發(fā)酵酒糟魚中菌群分布最為類似。

在A 組腌制魚中，魏斯氏菌屬呈紅色，是主要組成部分，對比B、C 兩組顯示，魏斯氏菌屬和不動桿菌屬（Acinetobacter）呈黃色，說明發(fā)酵抑制了兩組菌屬；而在B、C 兩組發(fā)酵酒糟魚中，乳酸桿菌始終占據(jù)優(yōu)勢，對比A 組藍(lán)色部分，Vagococcus、Vibrio、Staphylococcus、Salinivibrio、Enterococcus、Lactococcus 等菌屬呈現(xiàn)黃色及以上，說明其為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。

此外還可以明顯看出在兩種酒糟魚樣品中，各有自己獨(dú)特的微生物菌群，如B 組的Pediococcus 和Bacillus，C 組的Peptoniphilus。

2.4 菌群豐度差異分析

為了得出B、C 兩組菌群豐度的差異，對B 組和C 組做差異分析。圖8 所示為兩種發(fā)酵酒糟魚中的豐度比例，中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)，物種分類豐度的差異比例，圖中p 值＜0.05，表示各菌群豐度均差異顯著。

圖8 B、C 兩組樣本差異比較誤差異圖

由圖8 可看出，在25 種分類中，B 組的差異性菌群有16種，Buttiauxella、Pediococcus、Vibrio、Bacilus 差異較大；C 組的差異 性 菌 群 有 9 種，Weisselllaa、Psychrobacter、Peptoniphilus、Vagococcus 差異較大。

3 結(jié)論與討論

本研究采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)分析兩種不同酒糟魚樣品中菌群組成及變化情況。結(jié)果表明：發(fā)酵可以有效提高酒糟魚微生物群落分布多樣性，實(shí)驗(yàn)室自制酒糟魚菌種豐度低于市場酒糟魚，菌種多樣性和菌群豐度差異項(xiàng)高于市場酒糟魚。兩種酒糟魚菌群結(jié)構(gòu)存在差異，在屬水平上，實(shí)驗(yàn)室自制酒糟魚樣品中微生物主要以乳酸桿菌屬、布丘氏菌屬，小球菌屬，弧菌屬假單胞菌屬等為主；而市場上酒糟魚樣品中微生物菌屬以乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬，嗜冷桿菌屬，嗜凍菌屬等為主。相對于傳統(tǒng)的分離鑒定方法，高通量測序技術(shù)在檢測優(yōu)勢菌時更具優(yōu)勢，兩種酒糟魚樣品都以乳酸桿菌為主要優(yōu)勢菌種，其他優(yōu)勢菌種包括漫游球菌屬、葡萄球菌屬等6 種，對酒糟魚發(fā)酵過程影響顯著。同時不同發(fā)酵方式導(dǎo)致了兩種酒糟魚各有其特殊菌種，實(shí)驗(yàn)室自制酒糟魚以Buttiauxella、Pediococcus、Vibrio、Bacilus 等菌屬為主，市場酒糟魚以Weisselllaa、Psychrobacter、Peptoniphilus、Vagococcus 等菌屬為主。

高通量測序技術(shù)檢測不僅可以快速檢測微生物種類，對比不同發(fā)酵方式下酒糟魚的優(yōu)勢菌和特殊菌，優(yōu)化酒糟魚發(fā)酵工藝，還可以檢測酒糟魚發(fā)酵過程中微生物多樣性和豐富性，為酒糟魚成品的保藏提供一定的參考依據(jù)。