反相高效液相色譜法測定人血清中拉莫三嗪的濃度

王曉娟，袁君，黃慶，趙伍西

作者單位：1淮南市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 淮南232007；2淮南聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)系，安徽 淮南232007

拉莫三嗪（lamotrigine）是一種電壓門控式鈉離子通道阻滯劑，為廣譜抗癲癎藥，廣泛用于控制各種類型的癲癎發(fā)作，被抗癲癎藥物應(yīng)用專家共識［1］癲癎（2011 年）列為健康育齡期婦女特發(fā)性全面性癲癎及癥狀性部分性癲癎的首選用藥。但由于拉莫三嗪受遺傳因素、聯(lián)合用藥等因素影響，有效血藥濃度個體差異大，與劑量相關(guān)性差，治療窗窄，因此臨床應(yīng)用需進行拉莫三嗪的血藥濃度監(jiān)測［2-6］。本研究于 2013 年 5 月至 2016 年 5 月查閱相關(guān)文獻［7-9］建立了人體血清拉莫三嗪濃度的反相高效液相色譜方法，測定時間縮短，線性范圍擴大，準(zhǔn)確性提高，適用于拉莫三嗪血藥濃度的臨床常規(guī)監(jiān)測，為拉莫三嗪的個體化治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器Agilent1260 高效液相色譜儀，DADG1316A 檢測器；FA1104 電子天平（上海良平儀器廠）；XW-80A 渦旋振蕩器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；H-1850R 型號離心機（湖南湘儀儀器廠）；高純度氮氣和氮吹儀（BYDCY-24S）；DK-420數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），D1810C自動雙重純水蒸餾器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

1.2試劑拉莫三嗪對照品、艾司唑侖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號10075-20041、1219-0102）；乙腈含量≥99.9%（色譜純，批號S92150，sigma 公司）；正戊烷含量≥98.5%（色譜純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號20150310）；甲醇含量≥99.8%、乙酸乙酯含量≥99.5%、氯仿含量≥99.5%（均為色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20141022、20151202、20150921）；磷酸二氫鈉含量≥99.5%（天津市光復(fù)科技有限公司，批號20140731）；自制重蒸餾水；正常人空白混合血清（淮南市第一人民醫(yī)院檢驗科提供）。

1.3溶液的配制拉莫三嗪儲備液配制：精密稱取拉莫三嗪對照品25 mg，加入甲醇溶解，定容到100 mL容量瓶中，得250 mg/L拉莫三嗪儲備液。艾司唑侖內(nèi)標(biāo)液配制：精密稱取艾司唑侖對照品38.6 mg，加甲醇溶解，定容到50 mL 容量瓶中，得濃度為772 mg/L的艾司唑侖內(nèi)標(biāo)液。上述溶液放置在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱規(guī)格Agilent C18（4.6×150 mm，5 μm）（Agilent公司）；流動相配比為甲醇∶磷酸二氫鈉緩沖液（56∶44，pH 6.0）；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm，液相色譜柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2樣品處理精密吸取艾司唑侖內(nèi)標(biāo)液10 μL于離心管中氮氣吹干，加人混合血清樣品100 μL，乙酸乙酯 600 μL 渦旋 2 min，離心 5 min（8 000 r/min）。取出上清液，下層再次加入600 μL 乙酸乙酯，渦旋2 min，離心5 min（8 000 r/min），合并兩次上清液。55°C水浴，氮氣吹干，殘渣用流動相100 μL溶解，混勻30 s，離心5 min（8 000 r/min），于“2.1 色譜條件”下取10 μL進樣測定。

2.3方法專屬性取空白血清按“2.2”項下方法處理分析，拉莫三嗪和內(nèi)標(biāo)峰型良好，兩者保留時間分別為3.8 min 和11.5 min，空白血清內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。按照上述方法考察同時加入卡馬西平、苯妥英鈉及丙戊酸鈉對實驗的干擾，卡馬西平及苯妥英鈉保留時間分別為7.4 min和6.5 min，丙戊酸鈉無峰，三者均不干擾拉莫三嗪測定。結(jié)果見圖1。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍拉莫三嗪儲備液用甲醇稀釋，配成濃度分別為 0.10、0.50、2.50、10.00、25.00、50.00、100.00 mg/L 的拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液。按2.2 項下方法處理進樣測定。以拉莫三嗪與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），拉莫三嗪質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進行線性回歸。得拉莫三嗪回歸方程Y＝0.020 1X+0.025 2（r＝0.999 6），在0.10～100.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.10 mg/L。

2.5精密度和回收率取空白血清100 μL，準(zhǔn)確加入一定量的拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制低、中、高質(zhì)量濃度分別為0.25、2.50 和25.00 mg/L 的拉莫三嗪質(zhì)控血清，每個濃度各5份，取上述系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清樣品，按“2.2”項下方法操作，以當(dāng)日回歸方程計算各藥物濃度，以加入質(zhì)量濃度與實測質(zhì)量濃度之比計算相對回收率。上述3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清樣品在同一天內(nèi)分別測定3 次和連續(xù)3 d 每天測定1 次，測得的血藥濃度計算日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果見表1。

2.6穩(wěn)定性取2.5項方法配制的0.25、2.50、25.00 mg/L 濃度的拉莫三嗪質(zhì)控血清，室溫放置24 h，-20 ℃冰凍7 d 和-20 ℃冰凍1個月的穩(wěn)定性。按“2.2”項下方法操作，分別測定拉莫三在室溫放置24 h 和-20 ℃冷凍 7 d、1 個月前后的拉莫三嗪峰面積之比，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.5%、1.2%及0.9%，表明在此條件下，拉莫三嗪穩(wěn)定性良好。

圖1 拉莫三嗪和艾司唑侖的反相高效液相色譜圖：A為空白血清圖；B為拉莫三嗪血清圖；C為拉莫三嗪+艾司唑侖血清圖

表1 人血清中拉莫三嗪的精密度和回收率

3 討論

以艾司唑侖為內(nèi)標(biāo)，而非文獻報道［10-11］的氯唑沙宗，因可能需要同時監(jiān)測卡馬西平、苯巴比妥、苯妥英鈉等藥物的血濃度，可以縮短實驗時間和節(jié)約檢測成本，但多種成分同時監(jiān)測，拉莫三嗪與苯巴比妥分離度較差，還需進一步優(yōu)化。流動相的組成、比例選擇參考相關(guān)文獻［12-13］，甲醇與水，或乙腈與水影響拉莫三嗪和內(nèi)標(biāo)峰型，而采用甲醇∶磷酸二氫鈉緩沖液（56∶44，pH 6.0）峰型較為理想。乙酸乙酯作為萃取溶劑，比乙醚、乙酸乙酯、氯仿、正戊烷毒性低，雜質(zhì)峰少，回收率高而穩(wěn)定，分離效果好。但乙酸乙酯揮發(fā)慢，因此血樣處理采用55°C水浴，氮氣吹干。

應(yīng)用本方法監(jiān)測數(shù)百例服用拉莫三嗪病人的血清藥物濃度，所有病人的血清濃度均在0.10～100.00 mg/L線性之內(nèi)，無特殊情況當(dāng)天可以出監(jiān)測報告，說明該方法方便、快捷、準(zhǔn)確，能夠滿足拉莫三嗪血清濃度的臨床常規(guī)監(jiān)測需要，給臨床癲癎病人拉莫三嗪個體化治療提供科學(xué)、準(zhǔn)確的用藥依據(jù)。