羅貴鈴 牛燕燕 邵波 張曉萍 趙常志 孫偉

摘?要?采用電沉積法制備了ZnO納米棒修飾氧化銦錫（ITO）電極（ZnONR/ITO），利用四電極系統(tǒng)建立了一種高靈敏檢測(cè)輔酶Q10（UQ10）的光電化學(xué)分析新方法。利用玻碳電極為第二工作電極，將溶液中UQ10預(yù)還原為UQ10H2，可作為電子供體在ZnONR/ITO上發(fā)生氧化反應(yīng)，電子躍遷至導(dǎo)帶后，光電流降低，進(jìn)而用于檢測(cè)UQ10。對(duì)電沉積ZnO納米棒和光電化學(xué)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)測(cè)定條件下，UQ10濃度的對(duì)數(shù)與光電流成反比，線性檢測(cè)范圍為1.0×1012～1.0×105 mol/L，檢出限為3.3×1013 mol/L（S/N=3）。

關(guān)鍵詞?輔酶Q10; 光電化學(xué)分析; 四電極系統(tǒng); 氧化鋅納米棒

1?引 言

光致電化學(xué)（PEC）分析通常是借助具有光電響應(yīng)的納米材料修飾電極，以具有氧化還原性質(zhì)的小分子化合物（如抗壞血酸、多巴胺和過氧化氫）作為電子受體或電子供體，建立對(duì)被測(cè)物質(zhì)敏感的PEC分析系統(tǒng)[1，2]，目前已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、免疫、DNA等生化分析領(lǐng)域[3～6]。例如，鄭晨琰等[7]通過電沉積和水熱法在氟摻雜SnO2導(dǎo)電玻璃（FTO）表面修飾納米金（AuNPs）和三氧化鎢（WO3），制備WO3/AuNPs/FTO，用于自來水和維生素B12中Co2+的檢測(cè)。Zhu等[8]制備了三維CdS納米片包裹的碳纖維骨架光電極，用于PEC免疫分析檢測(cè)利鈉肽的含量。Li等[9]利用AuNPs敏化的垂直排列的板狀WO3修飾光電極，用于食用酒中乙醇含量的PEC檢測(cè)。

輔酶Q（Coenzyme Q）又稱泛醌（Ubiquinone，UQ），廣泛存在于生物膜中，是一類含不同長(zhǎng)度聚異戊烯側(cè)鏈的醌類化合物的總稱[10]。根據(jù)UQ側(cè)鏈異戊烯單位的數(shù)目不同，其命名也不同，人類和哺乳動(dòng)物含有的是10個(gè)異戊烯單位的UQ，稱為UQ10。人體中UQ10主要來源于生物合成以及飲食攝入，廣泛分布在人體組織中，尤其是線粒體的內(nèi)膜中，從而影響內(nèi)膜的流動(dòng)性和滲透性。在線粒體電子傳輸鏈和氧化磷酸化生成ATP的過程中，UQ10是必不可少的電子載體，具體作用機(jī)制為：UQ10可接受兩個(gè)氫，并獲得兩個(gè)電子，生成還原型UQ10（UQ10H2），進(jìn)而參與體內(nèi)的各種氧化還原反應(yīng)。UQ10H2還可將所含的一個(gè)氫原子傳遞給自由基，將自由基還原，自身被氧化為半還原態(tài); 被氧化的UQ10再經(jīng)過酶催化作用，恢復(fù)為還原態(tài)[11～13]。同時(shí)，UQ10在維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中起關(guān)鍵作用，具有抗氧化、抑制自由基的作用[14]。缺乏UQ10可能引起心力衰竭、高血壓、神經(jīng)退行性疾病和糖尿病等疾病，因此檢測(cè)UQ10的含量至關(guān)重要。目前，測(cè)定UQ10的方法主要有高效液相色譜法和質(zhì)譜法[15]等，這些方法能夠有效地進(jìn)行UQ10的定性和定量分析，但存在設(shè)備昂貴、靈敏度低、操作復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)，因此，亟需建立設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度高的快速檢測(cè)UQ10的方法。

納米ZnO的禁帶寬度為3.37 eV，具有電荷傳輸快、制備成本低、光電性能好等優(yōu)點(diǎn)，并能在生長(zhǎng)高質(zhì)量單晶襯底的同時(shí)進(jìn)行同質(zhì)外延，廣泛應(yīng)用于壓電材料、氣體傳感和生物傳感器等領(lǐng)域[16～20]。ZnO納米材料的可控生長(zhǎng)是實(shí)現(xiàn)其性能調(diào)控和實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)，已報(bào)道的ZnO納米材料包括納米棒[20]、納米線[21]、納米管陣列[22]和空心納米球[23]等，其中，ZnO納米棒（ZnONR）具有合成成本低、無毒、電子通路大、表面積大和電子傳輸率高等優(yōu)良性能，已被用于構(gòu)建PEC生物傳感器[24～26]。Kang等[24]在還原石墨烯層（rGO）上直接合成ZnONR陣列，ZnO/rGO基光陽極用于谷胱甘肽的自供電PEC生物傳感研究，檢測(cè)線性范圍為10～200 mmol/L，檢出限為2.17 mmol/L，表現(xiàn)出良好的選擇性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性。韓志鐘等[26]在導(dǎo)電玻璃表面利用水相法制備ZnO納米花-棒立體結(jié)構(gòu)作為電極，固定探針基因制得ZnO納米花-棒立體結(jié)構(gòu)基PEC生物傳感器，并用于無標(biāo)記檢測(cè)DNA。

本研究以UQ10作為電子供體設(shè)計(jì)PEC反應(yīng)系統(tǒng)，構(gòu)建了一種基于四電極系統(tǒng)的PEC分析平臺(tái)。四電極系統(tǒng)中，通過UQ10在第二工作電極（玻碳電極）表面預(yù)還原成UQ10H2，并作為第一工作電極（ZnONR/氧化銦錫導(dǎo)電玻璃，ZnONR/ITO）的電子供體而被氧化，電子躍遷至導(dǎo)帶，從而降低了光電流信號(hào)，通過光電流的降低值與UQ10濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)UQ10的定量分析。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

CHI 832B型雙通道電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）; PEAC 200A型光電化學(xué)反應(yīng)儀（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司，激發(fā)光波長(zhǎng)為365 nm）; 以ITO導(dǎo)電玻璃（8.0 mm×5.0 cm，深圳南玻集團(tuán)偉光公司）為基底制備的ZnONR/ITO作為第一工作電極，Ag/AgCl電極（飽和KCl溶液）為參比電極，鉑絲為對(duì)電極，玻碳電極（GCE，直徑3.0 mm）為第二工作電極（還原電極），組成四電極工作系統(tǒng); JSM-7100F掃描電子顯微鏡（SEM，日本電子株式會(huì)社）。

Zn（NO3）2·6H2O、無水乙醇（EtOH）和UQ10（阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰荆? LiClO4（成都化工試劑廠）; 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為支持電解質(zhì); 其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2?ZnONR/ITO的制備

采用電沉積的方法制備ZnONR/ITO[27]。將ITO導(dǎo)電玻璃依次在丙酮、乙醇和超純水中各超聲清洗15 min，氮?dú)獯蹈珊?，在一端留出約1.0 cm作為電極的端子，在另一端表面留出長(zhǎng)度為5.0 mm的空白作為ITO電極的工作面，其它部分用絕緣膠帶封住。采用三電極體系鍍膜，電解液的組成為2.5～5.0 mmol/L Zn（NO3）2和0.1 mol/L KCl，以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，Pt板為對(duì)電極，Pt絲為參比電極，恒溫60℃，設(shè)置Pt板的電極電勢(shì)為1.20～1.50 V，沉積時(shí)間設(shè)置為1500～5000 s，記錄時(shí)間-電流曲線，電沉積完成后，用超純水洗去表面吸附的雜質(zhì)，干燥后即得到ZnONR/ITO。

2.3?實(shí)驗(yàn)方法

采用四電極雙通道系統(tǒng)，ZnONR/ITO為第一工作電極，GCE為第二工作電極。將GCE的還原電位設(shè)定為0.35 V，ZnONR/ITO的偏壓為0.1 V，以0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液為支持電解質(zhì)?？疾靂nONR/ITO的基線電流穩(wěn)定性，GCE活化60 s后，以40 s為一個(gè)循環(huán)單位控制光電化學(xué)反應(yīng)儀光閘的開/關(guān)，記錄空白光電流曲線。然后向電解池中加入40 μL 1.0×103 mol/L UQ10溶液，電解液的總體積為4.0 mL。采用上述相同的方法，記錄樣品的電流-時(shí)間曲線，以樣品和空白光電流的差值定量檢測(cè)UQ10。

3?結(jié)果與討論

3.1?四電極系統(tǒng)的測(cè)試原理和電解池的構(gòu)造

UQ10分子結(jié)構(gòu)中存在共軛雙鍵，具有良好的電化學(xué)活性。由于UQ10的氧化電位低于氧的還原電位[28]，在水溶液中，UQ10通常以氧化態(tài)存在，無法作為電子供體，在光激發(fā)的ZnONR/ITO上失去電子發(fā)生PEC反應(yīng)。因此，必須借助于第二工作電極將UQ10還原，繼而才能被光激發(fā)的ZnONR氧化而產(chǎn)生光電流。四電極系統(tǒng)示意圖和四電極電解池如圖1所示。在四電極工作模式下，兩個(gè)工作電極的電位可分別設(shè)定，輸出電流可分別觀察記錄。

3.2?ZnONR/ITO的表征

采用SEM對(duì)ZnONR/ITO的形貌進(jìn)行表征。如圖2所示，在最優(yōu)電沉積條件下，制備的ZnONR呈六棱棒狀，均勻地生長(zhǎng)在ITO電極表面，納米棒的六棱柱直徑約320 nm。

3.3?ZnO納米棒電沉積條件

考察了電沉積時(shí)間（t）、沉積電位（Edep）和Zn（NO3）2濃度（C）對(duì)制備ZnONR/ITO的光電流（Photocurrent）響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。在電解液Zn（NO3）2溶液的初始濃度為3.5 mmol/L、電沉積電位為1.30 V和電沉積時(shí)間為3000 s條件下，制得ZnONR/ITO的光電響應(yīng)最好。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，過長(zhǎng)的沉積時(shí)間、過低的沉積電位或較高的Zn（NO3）2濃度，都會(huì)導(dǎo)致沉積層過厚，在長(zhǎng)時(shí)間的光電測(cè)試過程中，會(huì)有明顯的脫落現(xiàn)象，導(dǎo)致修飾電極ZnONR/ITO的穩(wěn)定性降低; 而過短的沉積時(shí)間或過低的沉積溫度，又會(huì)導(dǎo)致ITO表面沉積的ZnONR柱高過低，光電流響應(yīng)極弱。

3.4?UQ10的電化學(xué)行為

采用GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極的三電極系統(tǒng)，考察UQ10的電化學(xué)行為。由于UQ10水溶性較差，加入EtOH以改善UQ10的溶解度; LiClO4是水和非水溶液共用的支持電解質(zhì)，選擇LiClO4-EtOH-PBS作為電解液。取1.0×105 mol/L UQ10和1.0 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液于電解池中，記錄循環(huán)伏安（CV）曲線，如圖4A所示，通過CV圖確定了UQ10還原電位區(qū)間。UQ10在GCE表面0.30 V開始發(fā)生還原，0.45 V完成還原反應(yīng)。本研究引入GCE作為第二工作電極，進(jìn)一步采用四電極系統(tǒng)考察還原電位（Ered，0.5～ 0.1 V）對(duì)光電流響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4B所示，可見在GCE上的最佳還原電位為0.35 V。

3.5?ZnONR/ITO對(duì)UQ10的PEC響應(yīng)

采用計(jì)時(shí)電流法考察了ZnONR/ITO對(duì)UQ10的PEC響應(yīng)，結(jié)果如圖5所示。在0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS溶液中，ZnONR/ITO的光電流值為800 nA（圖5曲線a）; 而在含2.0×105 mol/L UQ10的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS溶液中，ZnONR/ITO的光電流值為301 nA（圖5曲線b），說明UQ10的存在減弱了ZnONR/ITO的PEC響應(yīng)。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，GCE上的還原電流（圖5曲線c）均比較穩(wěn)定，說明GCE對(duì)UQ10有電化學(xué)響應(yīng)，在0.35 V電位下，能夠很好地將UQ10還原為UQ10H2。

推測(cè)此反應(yīng)的機(jī)理如圖6所示，ZnONR受到光的激發(fā)后，外層電子從價(jià)帶躍遷至導(dǎo)帶，電子轉(zhuǎn)移到半導(dǎo)體電極從而產(chǎn)生光電流（圖6A）[29，30]; UQ10經(jīng)過第二工作電極GCE還原后形成UQ10H2，電子轉(zhuǎn)移到半導(dǎo)體電極的導(dǎo)帶，從而降低了光電流（圖6B）。通過測(cè)量光電反應(yīng)的電信號(hào)的變化，對(duì)底物實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

3.6?UQ10光電響應(yīng)條件優(yōu)化

UQ10的還原過程與電解液的pH值有關(guān)，進(jìn)而會(huì)影響PEC響應(yīng)。設(shè)置第一工作電極偏壓為0.10 V，第二工作電極的還原電位為0.35 V，考察不同pH值（6.0～8.0）對(duì)光電響應(yīng)的影響。采用計(jì)時(shí)電流法分別以不同pH值的含2.0×105 mol/L UQ10的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS和0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS為電解液，以光電流響應(yīng)差值表征不同pH值對(duì)UQ10還原反應(yīng)的影響（圖7A），并進(jìn)一步考察電解質(zhì)中PBS體積（V）對(duì)UQ10光電響應(yīng)的影響（圖7B），當(dāng)pH=6.5，PBS加入量為400 μL時(shí)，電解質(zhì)體系中酸堿度適中，既能提供足夠的質(zhì)子參與反應(yīng)，也能保持光電信號(hào)穩(wěn)定。

ZnONR是一種具有光電活性的無機(jī)納米材料，其電子狀態(tài)受電極電位的影響，考察偏壓（Ebias）對(duì)光電響應(yīng)的影響（圖7C）。在0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS（含2×105 mol/L UQ10）混合液中，當(dāng)偏壓為0.1 V時(shí)，光電流響應(yīng)最大。設(shè)置偏壓為0.10 V，考察激發(fā)光強(qiáng)度對(duì)光電流響應(yīng)的影響（圖7D），在實(shí)驗(yàn)過程中，通過改變光程（s）調(diào)整光強(qiáng)度。隨光程的增大，光電流強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在7 cm（對(duì)應(yīng)的光照強(qiáng)度為316 μW/cm2）時(shí)達(dá)到最大值; 隨著光程繼續(xù)增大，光電流逐漸減小，說明光強(qiáng)對(duì)光電響應(yīng)有顯著影響。這是由于過長(zhǎng)的光程導(dǎo)致光照強(qiáng)度降低，從而使ZnONR受光照產(chǎn)生電子-空穴對(duì)的效率降低，光電流下降。

3.7?ZnONR/ITO對(duì)UQ10的光電流響應(yīng)

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定ZnONR/ITO在不同濃度UQ10（C）的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液中的光電流響應(yīng)（圖8A），發(fā)現(xiàn)隨著UQ10濃度增加，光電流逐漸減小。由圖8B可知，光電流響應(yīng)在1.0×107 mol/L UQ10時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)后下降趨勢(shì)漸緩。UQ10的濃度在1.0×1012～1.0×105 mol/L范圍內(nèi)，其濃度的對(duì)數(shù)與光電流呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I（nA）=64.28 lg（C （mol/L））-230.0（R2=0.998），檢出限為3.3×1013 mol/L（S/N=3）。與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)UQ10方法（表1）相比，本方法的檢出限低于色譜法和光學(xué)法。

3.8?常見干擾物質(zhì)對(duì)光電流的影響

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了常見共存物質(zhì)對(duì)UQ10光電流響應(yīng)的影響，結(jié)果見表2。在2.0×106 mol/L UQ10的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液中，當(dāng)允許誤差<5%時(shí)，等濃度的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和維生素K3（VK3）會(huì)明顯干擾UQ10的測(cè)定; Fe3+、K+、Cl、Zn2+、NO3和丙氨酸不會(huì)干擾測(cè)定。這是由于FAD和VK3與UQ10的還原電位相近，還原后，電子躍遷到半導(dǎo)體的導(dǎo)帶上，光電流響應(yīng)增強(qiáng)，干擾UQ10的測(cè)定; 其它無機(jī)離子和氨基酸與UQ10的還原電位差距大，因此不會(huì)產(chǎn)生干擾。

3.9?ZnONR/ITO光電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

連續(xù)8次測(cè)定同一濃度的UQ10后，GCE的還原電流無明顯波動(dòng)，表明第二工作電極GCE在還原UQ10時(shí)沒有產(chǎn)生鈍化。平行制備5支工作電極，測(cè)定相同濃度UQ10光電流響應(yīng)的RSD<1.7%。ZnONR/ITO在干燥避光的環(huán)境下保存10天后，對(duì)同濃度的UQ10的光電流響應(yīng)減小0.8%; 保存20天后，光電流的響應(yīng)為初始光電流的81%。結(jié)果表明，ZnONR/ITO具有良好的穩(wěn)定性，說明電化學(xué)沉積法在ITO電極表面制備ZnONR過程中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并且ZnONR/ITO對(duì)UQ10的定量分析具有良好的穩(wěn)定性。

3.10?實(shí)際樣品分析

將ZnONR/ITO用于輔酶Q10膠囊（上海衡山藥業(yè)有限公司）的定量檢測(cè)。取3粒輔酶Q10膠囊的內(nèi)容物，混勻，稱取250 mg內(nèi)容物，在40 mL無水乙醇中超聲處理10 min，然后將混合物離心分離，取上清液，用乙醇定容至100 mL。進(jìn)一步取0.5 mL 樣品溶液稀釋并定容至10 mL，制得輔酶Q10膠囊樣品液。取40 μL樣品液，注入電解池（總體積為4.0 mL）中進(jìn)行光電檢測(cè)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算回收率，結(jié)果見表3，回收率在99.0%～104.5%之間。利用高效液相色譜法檢測(cè)輔酶Q10膠囊樣品中的UQ10含量[34]，與PEC檢測(cè)結(jié)果相近。結(jié)果表明，此四電極系統(tǒng)光電傳感器可用于輔酶Q10膠囊樣品中UQ10的含量分析。

4?結(jié) 論

采用電沉積的方法，將具有光電活性的ZnONR修飾在ITO電極表面，成功制備了ZnONR/ITO，此修飾電極同時(shí)具有光敏性和電子受體的功能，可大大提高光電轉(zhuǎn)換的效率。利用四電極雙通道電化學(xué)系統(tǒng)，以第二工作電極GCE作為還原電極，在0.35 V的電位下，可將溶液中的UQ10還原為UQ10H2，基于此建立了高靈敏檢測(cè)UQ10的新方法。本方法的檢測(cè)范圍為1.0×1012～1.0×105 mol/L，檢出限為3.3×1013 mol/L。

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