灰霉病菌（Botrytis Cinerea）是一種植物致病性子囊菌，侵染上千種植物，引起灰霉病，每年給水果、蔬菜和花卉造成超過10億美元的損失。由于其在世界范圍內(nèi)的發(fā)生、巨大的經(jīng)濟意義和非特異性的壞死性生活方式，它已被列為第二大植物病原真菌（點擊查看：十大植物病原真菌）。灰霉病的控制通常需要反復(fù)使用殺菌劑，特別是在高濕度條件下，但快速的適應(yīng)和抗藥性發(fā)展已經(jīng)大大降低了世界范圍內(nèi)許多大田和溫室作物的藥效。自從琥珀酸脫氫酶抑制劑殺菌劑（SDHI）以來，在過去的幾年里，沒有新的主要抗真菌作用模式來控制灰霉病。目前，灰霉病菌的基因組序列已經(jīng)發(fā)表，為灰霉病菌的遺傳操作提供了序列基礎(chǔ)。

2020年8月17日，國際著名期刊PLOS？Pathogens在線發(fā)表了來自德國凱澤斯勞滕大學(xué)生物系Matthias Hahn課題組題為：“CRISPR/Cas with ribonucleoprotein complexes and transiently selected telomere vectors allows highly efficient marker-free and multiple genome editing in Botrytis cinerea”的研究論文，首次建立了灰霉菌基因組的無標(biāo)記編輯的CRISPR/Cas體系！

目前，CRISPR/Cas已經(jīng)成為在不同生物體中進行基因操作的最先進技術(shù)，使得基因精準(zhǔn)改變能夠以前所未有的效率進行。CRISPR/Cas核糖核蛋白（CRISPR/Cas ribonucleoprotein，CRISPR/Cas RNP）復(fù)合體介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是當(dāng)前最重要的無外源DNA整合在基因組上的編輯技術(shù)之一。該技術(shù)摒棄了編碼Cas蛋白和向?qū)NA的DNA載體，在試管中將純化的Cas蛋白和向?qū)NA（gRNA）預(yù)先組裝成具備完整活性的CRISPR/Cas RNP復(fù)合體，再將CRISPR/Cas RNP通過物理或者化學(xué)的方法直接導(dǎo)入細胞，從源頭上避免了在受體基因組中插入外源DNA。同時，因為導(dǎo)入的是具有完整活性的CRISPR/Cas RNP復(fù)合體，CRISPR/Cas RNP進入細胞后可以立即發(fā)揮功能，迅速切割靶位點的基因組DNA;又由于Cas蛋白和向?qū)NA的半衰期均較短，細胞中又沒有新的Cas蛋白和向?qū)NA持續(xù)合成，所以CRISPR/Cas RNP對基因組DNA的切割被限定在一個短暫的時間內(nèi)，得到的編輯產(chǎn)物在嵌合率和脫靶率方面均優(yōu)于使用編碼Cas蛋白和向?qū)NA的DNA載體得到的編輯產(chǎn)物。

本研究首次建立了灰霉菌基因組的無標(biāo)記編輯的CRISPR/Cas體系，每次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生多達數(shù)千個編輯的轉(zhuǎn)化子。首先，通過利用SV40（4x）和Stua（2x）NLS序列的C末端串聯(lián)陣列實現(xiàn)了有效的Cas9核靶向，同時將有效的Cas9核靶向組成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），提高了CRISPR系統(tǒng)的高效遞送;其次，利用帶有端粒的質(zhì)粒實現(xiàn)無選擇標(biāo)記的篩選體系。其原理是，含有一對端粒的質(zhì)粒（Ptel）不僅可以有效地轉(zhuǎn)化到絲狀真菌中，并以著絲粒微染色體的形式在那里自主復(fù)制，并且在沒有選擇壓力的情況下很快就會丟失。作者將RNP和修復(fù)模板與不穩(wěn)定的端粒載體相結(jié)合，導(dǎo)入真菌原生質(zhì)體中進行基因編輯。研究證明，與現(xiàn)有的基于CRISPR/Cas的方法相比，這種方法在絲狀真菌（包括模式植物病原菌稻瘟菌）中提供了更好的基因編輯效率，并導(dǎo)致非常低數(shù)量的額外非靶標(biāo)突變。其有效性取決于：

1）提供選擇的端粒載體的高轉(zhuǎn)化效率;

2）質(zhì)粒載體和CRISPR組件的高共轉(zhuǎn)化/編輯率;

3）產(chǎn)生高效的HR和/或NHEJ;

4）在鑒定所需的編輯事件之后消除端粒載體，產(chǎn)生沒有任何其他基因組改變的編輯菌株。用這種方法，重復(fù)獲得了成百上千個轉(zhuǎn)化子，其中高達65%的轉(zhuǎn)化子是無標(biāo)記編輯的。

同時更重要的是，作者也證明該系統(tǒng)的編輯對另一種絲狀真菌稻瘟菌也起到了很好的作用，這表明它可以應(yīng)用于許多真菌。該轉(zhuǎn)化體系有望加速灰霉菌和其他真菌的分子研究。