李蕾 鄒婷婷 王聞天

【摘 要】 目的：探討分析舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221和miR-222的表達水平。方法：培養(yǎng)舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27和正?？谇簧掀ふ衬そ琴|(zhì)細胞HOK進行試驗研究，從培養(yǎng)細胞中提取外泌體，并采用實時熒光定量PCR檢測外泌體miR-21、miR-221和miR-222的表達水平。結(jié)果：舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221、miR-222表達水平顯著高于正常口腔上皮粘膜角質(zhì)細胞HOK（p<0.05）。結(jié)論：舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221和miR-222異常表達，有可能參與口腔癌的增殖、遷移與侵襲。

【關(guān)鍵詞】 舌鱗狀細胞癌細胞株;外泌體;miR-21;miR-221;miR-222

【中圖分類號】 R739.86 ? 【文獻標(biāo)志碼】A ? 【文章編號】1005-0019（2020）17-089-02 ?舌鱗狀細胞癌為口腔頜面部較常見的一種惡性腫瘤，具有發(fā)生率高、復(fù)發(fā)率高、存活率低、預(yù)后差等特點，故早期診治本病是患者預(yù)后改善的關(guān)鍵。近年，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展以及外泌體研究的不斷深入，已有大量研究證實外泌體在人體多種疾病特別是癌癥的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用。目前已有研究證實外泌體源性miR-142-3p可以促進舌鱗狀細胞癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移，致使患者預(yù)后不良[1]，但關(guān)于外泌體源性miR-21、miR-221、miR-222在舌鱗狀細胞癌細胞株的表達情況及作用鮮有報道，為此，本研究選擇舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27和正?？谇簧掀ふ衬そ琴|(zhì)細胞HOK進行試驗研究，以探析舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221和miR-222的表達水平。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng) 將CAL-27細胞放在含10%胎牛血清H-DMEM培養(yǎng)基，將HOK正?？谇簧掀そ琴|(zhì)細胞放在HOK培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為：濕度95%，溫度37℃，二氧化碳體積分數(shù)5%，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，并選擇對數(shù)生長期細胞作下一步試驗。

1.2 提取外泌體 將選中的細胞放置在細胞培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，待其融合到80%時應(yīng)用適量無菌PBS溶液對培養(yǎng)皿進行清洗，反復(fù)3次，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后收集10ml培養(yǎng)上清液離心處理15min已將大的細胞碎片去除，再離心處理20min將小的細胞碎片去除，離心處理30min去除大分子蛋白。此時收集上清液，根據(jù)4：1的比例添加沉降劑混勻，在4℃環(huán)境中靜置12h。再次離心處理5min，棄去上清液后收集到黃白色沉淀物即為外泌體。用PBS溶液洗滌沉淀并重懸外泌體且離心處理70min，棄去上清液后再次用PBS溶液重懸，并在-80℃環(huán)境中保存待用。

1.3 鏡下察看外泌體的形態(tài) 取10μL外泌體于銅網(wǎng)中進行沉淀過濾，吸取浮液;然后再在銅網(wǎng)上加入10μL2%磷戊酸過濾，吸取浮液。銅網(wǎng)在常溫下干燥2min后將其放在透射電鏡下察看外泌體的形態(tài)。

1.4 Western blot檢測 在外泌體中分別加入1mlTrizol裂解液、10μl苯甲基?；酋７?0μl的cocktail蛋白酶抑制劑以提取蛋白。取適量提取的蛋白溶液，加入4倍量的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，進行SDS-PAGE電泳實驗。電泳結(jié)束后將凝膠取出，放在濾紙上使其形成凝膠轉(zhuǎn)印堆積層，進行western-blot轉(zhuǎn)膜。加入適量CD63、CD81單克隆抗體稀釋，在4℃環(huán)境中孵育24h，進行TBST洗膜，再加入適量二抗稀釋液在室溫下孵育1h，TBST洗膜。隨后把雜交膜放置在透明塑料板，并加入適量化學(xué)熒光發(fā)光底物，靜置5min后吸取雜交膜表面的底物液，并將雜交膜放到暗盒中讓其顯影。

1.5 實時熒光定量PCR檢測 先根據(jù)TRNzol Universal總RNA提取試劑盒的說明書操作步驟進行miRNA提取，再依據(jù)All-in-One First Strand Synthesis Kit試劑盒說明書獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，設(shè)置PCR循環(huán)反應(yīng)條件：激活95℃ 120s;變性95℃ 15S，退火 60℃ 60S，40個循環(huán)進行Q-PCR反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用統(tǒng)計學(xué)SPSS23.0軟件，計量資料經(jīng)t檢驗，P<0.05為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在透射鏡下見CAL27癌細胞株、HOK正常細胞中均含有外泌體，直徑范圍在50～100nm，外形基本相似，均為橢圓形，且經(jīng)Western blot檢測見外泌體中含有CD81、CD63特異性抗體，進一步證實檢測到外泌體。而且舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221、miR-222表達水平顯著高于正常口腔上皮粘膜角質(zhì)細胞HOK（p<0.05），見圖1。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實[2]，外泌體源性miRNA對腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥具有一定的調(diào)節(jié)作用，有望成為癌癥治療的新研究方向。相關(guān)文獻報道[3]，在乳腺癌、肺癌細胞提取所得的外泌體中可發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-221和miR-222表達異常升高。有研究也發(fā)現(xiàn)[4]，miR-21、miR-221、miR-222為口腔癌早期診斷的標(biāo)志物之一，其能夠提高癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，阻止腫瘤凋亡。除此之外，miR-221、miR-222還可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-3的表達水平，使腫瘤細胞對阿霉素等化療藥物的敏感性降低，促進耐藥。本研究結(jié)果也顯示，舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221、miR-222表達水平顯著高于正常口腔上皮粘膜角質(zhì)細胞HOK。由此可見，舌鱗狀細胞癌細胞株CAL27外泌體源性miR-21、miR-221和miR-222異常表達，有可能參與口腔癌的增殖、遷移與侵襲，但其具體作用機制有待進一步研究。

參考文獻

[1] 唐慧，伍海姍，楊怡，等.外泌體源性microRNA在疾病診療中的研究進展[J].中南大學(xué)學(xué)報2015，40（11）：1270-1275.

[2] 姜鵬玲，張思浩，徐織，等.Exosomal miRNAs在腫瘤治療中的研究進展[J].臨床普外科電子雜志，2019，7（2）：35-39.

[3] 熊武，孫安夢，皇毅，等.內(nèi)皮祖細胞外泌體中與血管生成相關(guān)的miRNAs生物信息學(xué)分析[J].中國醫(yī)師雜志，2019，21（4）：499-502.

[4] 周李杰，余東升.miR-221/222在腫瘤中的研究進展[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志，2016，10（5）：356-359.