張倩倩 鄭松柏

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科(200040)

背景：老年人胃腸動(dòng)力障礙性疾病高發(fā)，可能與腸肌間神經(jīng)叢(MP)的老化有關(guān)。目的：探討不同月齡大鼠結(jié)腸MP的形態(tài)結(jié)構(gòu)隨增齡的變化。方法：將14只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按年齡分為6、18和25月齡組，以HE染色測(cè)定MP及其神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化，免疫組化染色檢測(cè)蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和c-kit免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果：三組大鼠MP內(nèi)神經(jīng)節(jié)面積(H=8.14，P=0.02)、神經(jīng)節(jié)密度(F=4.12, P=0.046)、神經(jīng)元胞體面積(F=9.60，P=0.00)、神經(jīng)元胞核面積(H=9.29，P=0.01)、每個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量(F=7.60，P=0.01)以及PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量(F=26.11，P=0.00)、AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量(H=11.83，P=0.00)、nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量(F=20.77，P=0.00)、c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(F=14.25，P=0.00)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與6月齡組相比，18月齡組、25月齡組神經(jīng)節(jié)面積、神經(jīng)元胞體面積、神經(jīng)元胞核面積顯著升高(P<0.05)，而神經(jīng)節(jié)密度、每個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量、PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量、c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：隨著增齡，MP存在明顯的衰老(或稱退化)和代償現(xiàn)象，這可能與老年人胃腸動(dòng)力減退、胃腸動(dòng)力障礙性疾病高發(fā)有密切關(guān)系。

老年人功能性消化不良、慢性便秘等胃腸動(dòng)力障礙性疾病高發(fā)[1-4]，但其機(jī)制尚不明確，可能與消化道肌間神經(jīng)叢(myenteric plexus, MP)隨增齡而發(fā)生衰老等因素有關(guān)[5-7]。MP是腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system, ENS)的重要組成部分，其神經(jīng)元通過(guò)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿、P物質(zhì)和5-羥色胺)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(如一氧化氮、血管活性腸肽和生長(zhǎng)抑素等)調(diào)節(jié)消化道運(yùn)動(dòng)功能。因此，MP退化可能是老年人胃腸道動(dòng)力低下的重要原因。本研究通過(guò)對(duì)不同月齡的大鼠結(jié)腸MP內(nèi)神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元形態(tài)以及蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和c-kit免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行分析，旨在探討MP隨增齡變化的特點(diǎn)及其與腸道運(yùn)動(dòng)功能的關(guān)系，從一個(gè)側(cè)面了解老年人胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取4只6月齡(體質(zhì)量472.40～521.30 g)、5只18月齡(體質(zhì)量632.30～687.50 g)和5只25月齡(體質(zhì)量702.50～750.00 g)SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[合格證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。按照網(wǎng)站https://www.taletn.com/rats/age/，將不同月齡大鼠的年齡換算成人類年齡，分別為18歲、45歲和62歲。大鼠自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)于溫度為(24±2) ℃、相對(duì)濕度為50%±5%的環(huán)境中，自然光照，12 h明暗周期，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

二、研究方法

1. 標(biāo)本獲?。核袆?dòng)物在取材前1 d 20∶00后禁食、禁水，取材當(dāng)天稱重后，采用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，剖腹，以肛門為起點(diǎn)，于距肛門8.0 cm處(相當(dāng)于乙狀結(jié)腸和直腸交界部位)取全層腸段1.0 cm。

2. HE染色：將腸段置于4%甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。行HE染色，二甲苯脫蠟，中性樹脂封片。由2名病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，測(cè)量神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標(biāo)：①應(yīng)用Image J軟件在200倍鏡下測(cè)量標(biāo)本長(zhǎng)度，手動(dòng)勾勒出神經(jīng)節(jié)輪廓，測(cè)量神經(jīng)節(jié)面積；②在400倍鏡下逐一計(jì)數(shù)MP中神經(jīng)節(jié)數(shù)量，計(jì)算神經(jīng)節(jié)密度(神經(jīng)節(jié)密度=標(biāo)本中神經(jīng)節(jié)數(shù)量/標(biāo)本長(zhǎng)度)；③在400倍鏡下，每張切片選擇10～20個(gè)切面完整的神經(jīng)元，應(yīng)用Image J軟件手動(dòng)勾勒出神經(jīng)元及其細(xì)胞核輪廓，測(cè)量并記錄神經(jīng)元及其細(xì)胞核的面積[8-9]。

3. 免疫組化染色：將石蠟切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、封閉，滴加一抗兔抗鼠PGP9.5(購(gòu)自Abcam，以1∶1 000稀釋)、兔抗鼠AChE(購(gòu)自Diagbio，以1∶20稀釋)、兔抗鼠nNOS(購(gòu)自Abcam，以1∶500稀釋)、兔抗鼠c-kit單克隆抗體[購(gòu)自愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司，以1∶200稀釋]4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌，滴加二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木素染核，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

結(jié)果判斷：PGP9.5、AChE和nNOS均定位于細(xì)胞質(zhì)，以MP中細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性；c-kit定位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜，以內(nèi)環(huán)肌和外縱肌之間細(xì)胞質(zhì)和(或)質(zhì)膜呈棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性。兩名病理科醫(yī)師在高倍鏡下(×400)觀察，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)神經(jīng)節(jié)，計(jì)數(shù)每個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)PGP9.5免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量；每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)內(nèi)環(huán)肌與外縱肌之間PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并記錄均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的形態(tài)學(xué)增齡變化

三組大鼠結(jié)腸壁內(nèi)環(huán)肌和外縱肌間均可見(jiàn)MP及其神經(jīng)節(jié)，6月齡大鼠神經(jīng)節(jié)面積小，數(shù)量多，其內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量多，神經(jīng)元胞質(zhì)呈粉紅色，胞核呈紫藍(lán)色。18月齡和25月齡大鼠神經(jīng)節(jié)面積增大，神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元胞體和胞核染色較6月齡淺，胞核面積增大。三組大鼠神經(jīng)纖維均呈淡粉色，相互交織成網(wǎng)，6月齡組神經(jīng)纖維排列整齊、致密，18月齡組略疏松，25月齡組神經(jīng)纖維排列雜亂、扭曲(圖1A-1I)。

二、神經(jīng)節(jié)面積和神經(jīng)節(jié)密度的增齡變化

三組MP內(nèi)神經(jīng)節(jié)面積相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=8.14，P=0.02)，且18月齡組和25月齡組顯著高于6月齡組(P=0.01，P=0.01)，而25月齡組與18月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組神經(jīng)節(jié)密度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.12，P=0.046)，其中25月齡組較6月齡組顯著下降(P=0.02)，其余各組間相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

三、神經(jīng)元面積和數(shù)量的增齡變化

三組神經(jīng)元胞體面積相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.60，P=0.00)，其中18月齡組和25月齡組顯著高于6月齡組(P=0.02，P=0.01)，而18月齡組和25月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組神經(jīng)元胞核面積相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.29，P=0.01)，其中18月齡組和25月齡組顯著高于6月齡組(P=0.01，P=0.01)，而18月齡組和25月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組每個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.60，P=0.01)，其中18月齡組和25月齡組顯著低于6月齡組(P=0.01，P=0.00)，而18月齡組與25月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 三組大鼠神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元形態(tài)學(xué)增齡變化

四、MP內(nèi)PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的增齡變化

免疫組化染色可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，灶狀分布于內(nèi)環(huán)肌和外縱肌之間，胞體大小不等，形態(tài)多樣，細(xì)胞核呈藍(lán)色。三組間PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.11，P=0.00；H=11.83，P=0.00；F=20.77，P=0.00；F=14.25，P=0.00)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，18月齡組和25月齡組MP內(nèi)PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)元均較6月齡組顯著減少(P=0.00，P=0.00)，18月齡組與25月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；18月齡組和25月齡組MP內(nèi)AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較6月齡組顯著減少(P=0.01，P=0.01)，25月齡組又顯著低于18月齡組(P=0.00)；18月齡組和25月齡組MP內(nèi)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較6月齡組顯著降低(P=0.00，P=0.00)，而18月齡組與25月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；18月齡組和25月齡組c-kit陽(yáng)性細(xì)胞較6月齡組顯著減少(P=0.00，P=0.00)，而18月齡組與25月齡組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A-2L、表2)。

表2 各組大鼠PGP9.5、AChE、nNOS和c-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的增齡變化

A-C：PGP9.5；D-F：AChE；G-I：nNOS；J-L：c-kit

討 論

腸道平滑肌受ENS和外來(lái)神經(jīng)(迷走神經(jīng)和脊神經(jīng))支配，其中ENS起主導(dǎo)作用[10]。ENS由黏膜下神經(jīng)叢和MP組成，MP內(nèi)神經(jīng)元通過(guò)分泌神經(jīng)遞質(zhì)可直接調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。腸腔內(nèi)的化學(xué)信號(hào)和機(jī)械信號(hào)經(jīng)迷走神經(jīng)傳入纖維和脊神經(jīng)傳入纖維分別傳導(dǎo)至腦干背側(cè)孤束核和脊髓背角，通過(guò)上行神經(jīng)傳導(dǎo)束投射至大腦皮質(zhì)，大腦皮質(zhì)接收信號(hào)后經(jīng)迷走神經(jīng)和脊神經(jīng)傳導(dǎo)至MP，從而調(diào)節(jié)腸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)。此外，ENS可通過(guò)蠕動(dòng)反射獨(dú)立調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。

老齡是腸道動(dòng)力障礙的重要危險(xiǎn)因素之一。老年人反流性食管炎、慢性便秘和功能性消化不良等疾病的患病率顯著高于中青年人[6,11]。60歲以上老年人功能性消化不良患病率達(dá)11.30%[3]，84歲及以上老年人慢性便秘患病率可達(dá)20.00%～37.30%[4]。乙狀結(jié)腸與直腸交界處是MP隨增齡退化最為顯著的部位[12-13]。因此，本研究選擇距肛門8 cm處的腸段(相當(dāng)于乙狀結(jié)腸與直腸交界部位)為標(biāo)本，探討MP隨增齡的變化。

Sun等[14]的研究以蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光法對(duì)2、16和20月齡C57BL/6J小鼠結(jié)腸MP神經(jīng)元進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，20月齡組神經(jīng)元數(shù)量顯著低于2和16月齡組。Bernard等[15]以免疫熒光法檢測(cè)人結(jié)腸MP內(nèi)神經(jīng)元HuC/D表達(dá)，結(jié)果顯示神經(jīng)元總數(shù)量隨增齡顯著下降。本研究對(duì)6、18和25月齡大鼠結(jié)腸MP神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化以及相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示神經(jīng)節(jié)密度和每個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量均隨增齡顯著下降，而神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元及其胞核的面積隨增齡顯著增加，神經(jīng)纖維排列逐漸紊亂，這些變化可能是對(duì)神經(jīng)元丟失產(chǎn)生的代償反應(yīng)[14-16]。

MP神經(jīng)元依據(jù)神經(jīng)遞質(zhì)的不同可分為多種亞型，膽堿能神經(jīng)元是ENS的主要興奮性神經(jīng)元。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸組織AChE陽(yáng)性神經(jīng)元隨增齡逐漸減少，與Sun等[14]的研究結(jié)果一致。在體外，以同等強(qiáng)度的電流刺激青年組和老年組狒狒結(jié)腸平滑肌，老年組肌肉收縮力顯著下降，但加入膽堿能受體抑制劑阿托品后，再給予兩組同等強(qiáng)度的電刺激，老年組平滑肌收縮抑制作用顯著低于青年組，提示老年組結(jié)腸MP內(nèi)膽堿能神經(jīng)元數(shù)量低于青年組[6]。

目前關(guān)于氮能神經(jīng)元數(shù)量隨增齡的變化尚存爭(zhēng)議。Takahashi等[17]發(fā)現(xiàn)，隨著增齡，F(xiàn)isher大鼠每個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著下降(P<0.01)，22～28月齡大鼠結(jié)腸組織nNOS mRNA和蛋白表達(dá)較4～8月齡組分別下降35%和54%。Gamage等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，雖然18～19月齡和24～25月齡C57BL/6小鼠MP內(nèi)NO能神經(jīng)元數(shù)量無(wú)明顯差異，但24～25月齡神經(jīng)纖維密度增加，并可見(jiàn)軸突腫脹、扭曲等表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量隨增齡顯著下降，神經(jīng)纖維隨增齡排列逐漸紊亂。推測(cè)神經(jīng)元丟失后，尚存神經(jīng)元之間聯(lián)系減少，故神經(jīng)纖維代償性增粗、增長(zhǎng)以加強(qiáng)神經(jīng)元間信號(hào)傳輸。本研究中，與18月齡組相比，25月齡組AChE陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著下降，而nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元無(wú)明顯變化，提示興奮性神經(jīng)元與抑制性神經(jīng)元的老化可能是非同步的、不平衡的，且抑制性神經(jīng)元受年齡的影響較小。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICCs)位于消化道肌層內(nèi)，是胃腸道慢波起搏細(xì)胞，與MP內(nèi)神經(jīng)元共同調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。李永等[12]對(duì)3、9、18、24和30月齡SD大鼠腸道傳輸速度以及胃體、空腸、回腸、結(jié)腸和乙狀結(jié)腸與直腸交界處5個(gè)部位的ICCs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20和24月齡組腸道傳輸速度減慢；各部位c-kit表達(dá)均隨增齡而下降，尤以結(jié)腸與直腸交界處最為明顯。Sun等[14]發(fā)現(xiàn)，24月齡C57BL/6J小鼠結(jié)腸ICCs顯著下降。24月齡組Fischer344大鼠升結(jié)腸和降結(jié)腸c-kit表達(dá)顯著低于6周齡組[19]。本研究中，25月齡SD大鼠c-kit表達(dá)顯著低于6月齡組，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究證實(shí)老年MP存在衰老(或稱退化)和代償現(xiàn)象，與老年人胃腸動(dòng)力減退關(guān)系密切，為闡明胃腸動(dòng)力障礙性疾病高發(fā)的機(jī)制提供了一些實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)?？紤]到衰老是不可逆轉(zhuǎn)的，而代償是有限的，因此建議未來(lái)研究應(yīng)關(guān)注MP神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)方面，為治療老年人胃腸動(dòng)力障礙性疾病尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)。