王文慧，邵志葉，陳豪

（1.杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院 病理科，浙江 杭州 310000；2.慈溪市婦幼保健院病理科，浙江 慈溪 315300）

人乳頭瘤病毒感染為宮頸癌發(fā)病的根本原因，而宮頸癌發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過程，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。隨著研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到宮頸癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟共同導(dǎo)致的過程，從正常宮頸發(fā)展到宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN），再發(fā)展為宮頸癌。在這個(gè)過程中，原癌基因激活和抑癌基因突變或缺失發(fā)揮重要作用。關(guān)于原癌基因和抑癌基因變化的研究是宮頸癌發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。Hippo信號(hào)通路為惡性腫瘤的抑制通路，在惡性腫瘤發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1]，Hippo-Yes相關(guān)蛋白1（Hippo-Yes-associated protein1,YAP1）位于該通路下游，為Hippo 通路轉(zhuǎn)錄共激活因子[2]，參與生長、發(fā)育及DNA 修復(fù)等過程，在結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，發(fā)揮抑癌基因的角色[3]。本文對(duì)宮頸癌組織中YAP1表達(dá)進(jìn)行研究，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月—2019年6月杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院和慈溪市婦幼保健院收治的100例宮頸癌患者的宮頸癌組織作為宮頸癌組，100例宮頸CIN 患者的宮頸組織作為CIN組，100例子宮肌瘤患者的正常宮頸組織作為正常組。宮頸癌組年齡（48.75±6.16）歲；臨床分期：I期58例，Ⅱ期42例；鱗癌69例、腺癌31例；低分化19例，中分化42例，高分化39例；宮旁浸潤深度：≤1/3 者31例，＞1/3 者69例；神經(jīng)脈管浸潤67例；宮旁浸潤65例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例。CIN組年齡（47.59±6.54）歲，正常組年齡（47.82±6.73）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①正常組選自子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者，病理證實(shí)宮頸組織正常；②CIN組選自宮頸錐切患者，病理證實(shí)為宮頸CIN；③宮頸癌組為行廣泛性子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)患者，病理證實(shí)為宮頸癌；④3組均臨床資料完整、依從性好、接受正規(guī)治療和隨訪，以及足夠樣本量進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他惡性腫瘤；②隨訪過程中失訪；③宮頸癌復(fù)發(fā)；④既往接受放化療等其他治療。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。3組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器鼠抗人YAP1 單克隆抗體購自美國Epitomics公司，二抗購自上海羅氏有限公司，DAB顯色劑購自上海羅氏有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色將3組宮頸組織石蠟切片經(jīng)烤箱烘烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸緩沖液高溫修復(fù)抗原，過氧化氫孵育10 min，加入一抗。兔抗人YAP1 單克隆抗體（1∶400）過夜孵育，加入二抗（1∶2 000）孵育1 h，DAB顯色，HE染色1 min，鹽酸乙醇分化30 s，氨水返藍(lán)1 min，常規(guī)脫水、透明、封固。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。結(jié)果判斷：YAP1陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。①染色程度：無染色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。②陽性細(xì)胞率：≤5%計(jì)0分；＞5%～25%計(jì)1分；＞25%～50%計(jì)2分；＞50%～75%計(jì)3分；＞75%計(jì)6分。染色程度和陽性細(xì)胞染色率相乘得到總分：總分0～2分為陰性；總分≥3分為陽性[4]。

1.3 隨訪

定期進(jìn)行門診或電話隨訪了解患者預(yù)后，隨訪開始時(shí)間為宮頸癌手術(shù)日期，隨訪截止時(shí)間為2019年12月31 日或死亡時(shí)間。無病生存期（disease-free survival,DFS）為手術(shù)日期至出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止時(shí)間；總生存期（total survival,OS）為手術(shù)日期至死亡或隨訪截止時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meie 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；預(yù)后影響因素用多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組宮頸組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率比較

正常組、CIN組、宮頸癌組宮頸組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率分別為13%、42%和78%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=85.930，P=0.000），CIN組、宮頸癌組高于正常組（P＜0.05），且宮頸癌組高于CIN組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組宮頸組織染色 （×400）

2.2 不同因素的宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率比較

不同臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），臨床分期Ⅱ期宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率高于I期；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而不同年齡、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、宮頸浸潤深度、神經(jīng)脈管是否浸潤及宮旁是否浸潤的宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 宮頸癌YAP1陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組生存時(shí)間比較

100例宮頸癌患者DFS中位數(shù)為61.15個(gè)月（95% CI：58.76，63.32）。其中，宮頸癌YAP1陽性表達(dá)組78例，DFS中位數(shù)為54.27個(gè)月（95% CI：52.16，67.36），5年DFS率為3.85%（3/78）；YAP1 陰性表達(dá)組22例，DFS中位數(shù)為87.76個(gè)月（95% CI：85.54，90.73），5年DFS率為0.00%（0/22）。兩組DFS比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.241，P=0.023），YAP1陽性表達(dá)組低于YAP1陰性表達(dá)組。見圖2。

100例宮頸癌患者OS中位數(shù)為63.57個(gè)月（95% CI：61.25，65.02）。其中，宮頸癌YAP1陽性表達(dá)組OS中位數(shù)為61.27個(gè)月（95% CI：58.76，53.64）；YAP1 陰性表達(dá)組OS中位數(shù)為93.61個(gè)月（95% CI：90.25，96.02）。兩組OS比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.201，P=0.014），YAP1陽性表達(dá)組低于YAP1 陰性表達(dá)組。見圖3。

2.4 YAP1 對(duì)宮頸癌預(yù)后的影響

以O(shè)S為因變量（賦值為總生存期實(shí)際值），以YAP1（陽性=1，陰性=0）、腫瘤大?。ㄙx值為實(shí)測(cè)值）、臨床分期（I期=0，Ⅱ期=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無=0，有=1）為自變量，進(jìn)行逐步多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)分析，引入水準(zhǔn)為0.05，剔除水準(zhǔn)為0.10。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，YAP1表達(dá)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為宮頸癌OS的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。見表2。

表1 不同因素的宮頸癌組織中YAP1蛋白陽性表達(dá)率比較 （n=100）

圖2 YAP1不同表達(dá)宮頸癌患者的DFS

圖3 YAP1不同表達(dá)宮頸癌患者的OS

表2 宮頸癌總生存期影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析參數(shù)

3 討論

Hippo信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，與惡性腫瘤的發(fā)病關(guān)系密切，尤其與其抑癌基因失活關(guān)系密切[5-6]。YAP1被證實(shí)為原癌基因，保護(hù)多個(gè)特異氨基酸結(jié)構(gòu)域，通過這些氨基酸結(jié)構(gòu)域與一些蛋白質(zhì)發(fā)生作用，參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。在Hippo 信號(hào)通路中，YAP1 發(fā)揮中心效應(yīng)作用[8]。在生理?xiàng)l件下Hippo信號(hào)通路為一條激酶鏈，由多種抑癌因子共同構(gòu)成，通過使YAP1 磷酸化，進(jìn)而抑制YAP1 轉(zhuǎn)錄共激活活性，維持細(xì)胞增殖和凋亡的平衡[9-10]。當(dāng)YAP1 過度表達(dá)或活性增加時(shí)，可激活下游靶基因表達(dá)，從而改變細(xì)胞增殖和凋亡的平衡[11-12]。在惡性腫瘤組織中，Hippo信號(hào)通路遭到破壞，導(dǎo)致YAP1 去磷酸化，活性增加，活化的YAP1 可誘導(dǎo)細(xì)胞增生相關(guān)的基因高度表達(dá)、抑制凋亡基因過度表達(dá)，從而打破細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，促進(jìn)細(xì)胞過度增殖[13]，導(dǎo)致乳腺癌[14]、胰腺癌[15]等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。故推測(cè)YAP1 在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮致癌基因角色[16-17]。

HE 等[18]發(fā)現(xiàn)，Hippo/YAP途徑和HPV致瘤蛋白相互作用調(diào)節(jié)宮頸癌的進(jìn)展。ZHANG 等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-136/TFCP2/YAP 途徑在宮頸癌中發(fā)揮致癌作用?；莼鄣萚20]發(fā)現(xiàn)，沉默YAP1 可影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。上述研究表明，YAP1 可通過多種途徑參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，但上述研究主要對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行研究。本文對(duì)宮頸癌組織中YAP1的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中YAP1高表達(dá)率高于宮頸CIN組織，宮頸CIN組織中YAP1高表達(dá)率高于正常宮頸組織，宮頸癌組織中YAP1高表達(dá)與宮頸癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。李靈芝等[21]對(duì)宮頸癌組織中YAP1表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，YAP1蛋白在宮頸癌前病變中呈高表達(dá)，在宮頸癌篩查中具有一定價(jià)值。本研究結(jié)果與該研究結(jié)果一致，表明YAP1 在宮頸癌癌前病變中已表達(dá)異常，檢測(cè)YAP1表達(dá)在宮頸癌篩查和防治中具有一定價(jià)值。李娜等[4]研究發(fā)現(xiàn)，YAP 在宮頸癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，與宮頸癌臨床分期無關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中YAP1與宮頸癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。本研究與李娜等[4]研究結(jié)果不完全一致，分析可能與病例數(shù)少、病例來自不同醫(yī)院等因素有關(guān)。結(jié)合上述基礎(chǔ)研究結(jié)果得知，沉默YAP1 可影響宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，分析YAP1在宮頸癌增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用，YAP1高表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌增殖和侵襲。

本文對(duì)YAP1高表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)YAP1高表達(dá)組患者DFS和OS較短，YAP1表達(dá)為宮頸癌OS的獨(dú)立影響因素。分析在宮頸癌組織中，Hippo信號(hào)通路受到破壞，導(dǎo)致YAP1 去磷酸化，YAP1 活性增加，活化的YAP1 可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其侵襲能力，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，宮頸癌臨床分期較高，并出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致宮頸癌嚴(yán)重程度增加，預(yù)后較差。

綜上所述，宮頸癌組織中YAP1 呈高表達(dá)，YAP1表達(dá)水平一定程度上可反映宮頸癌的嚴(yán)重程度，在預(yù)測(cè)預(yù)后上也具有一定的輔助價(jià)值。