原小燕 王虎 劉映雪

摘要：本研究建立了飼料中嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)方法。飼料樣品經(jīng)70%甲醇溶液提取，過濾后，用0.01MpH7.4PBS復(fù)溶，結(jié)果表明，嘔吐毒素在0.5～8毫克/公斤濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.999。以配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混料為添加基質(zhì)，其回收率在80%～120%，檢出限為500ppb。結(jié)論顯示，本方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足飼料中嘔吐毒素的分析檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：嘔吐毒素;飼料;熒光定量檢測(cè)試紙

1材料與方法

1.1儀器與試劑

熒光免疫分析儀（蘇州和邁精密儀器有限公司），XH-C渦旋混合器（新寶儀器有限公司），稱量天平（DIGITAL SCALE）。嘔吐毒素單克隆抗體和嘔吐毒素半抗原一牛血清白蛋白偶聯(lián)物，購自武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司;MES，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EDC，購自國藥集團(tuán);試劑牛血清白蛋白，購自上海生工生物工程有限公司;時(shí)間分辨熒光微球，購自上海輝質(zhì)生物科技有限公司;嘔吐毒素及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sigma公司;硝酸纖維素膜，購自MDI。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣本處理方法稱取2.0土0.05克研碎的樣本至50毫升離心管中，加入10毫升樣本提取液，用振蕩器充分振蕩5分鐘，將振蕩后的樣本用定量分析濾紙過濾，用樣本稀釋液將濾液按1：79比例稀釋（例，10微升濾液+790微升樣本稀釋液），取稀釋后液體進(jìn)行檢測(cè)（稀釋系數(shù)400）。

1.2.2操作步驟打開熒光免疫分析儀，同時(shí)撕開檢測(cè)試紙鋁箔袋，取出檢測(cè)試紙，放于平整、潔凈的臺(tái)面上。用配套吸管吸取待檢樣本，垂直而緩慢的滴加2～3滴（約60微升）到加樣孔內(nèi)。靜置10分鐘，，上機(jī)檢測(cè)，超過20分鐘的結(jié)果無效。熒光免疫分析儀操作：輕按開機(jī)鍵開機(jī)——點(diǎn)擊“系統(tǒng)設(shè)置”——點(diǎn)擊“檢測(cè)項(xiàng)目管理”——選擇需檢測(cè)的項(xiàng)目（嘔吐毒素）——將檢測(cè)試紙插人檢測(cè)孔內(nèi)——點(diǎn)擊“快速測(cè)試”開始檢測(cè);檢測(cè)下一個(gè)樣本擊“快速檢測(cè)””即可當(dāng)檢測(cè)結(jié)果大于80微克/公斤時(shí)，可用樣本稀釋液將上述檢測(cè)液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測(cè)，所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1包被量的確定

用0.lMNa，HPO，將包被抗原（5.7毫克/毫升）按照0.399毫克/毫升，0.456毫克/毫升和0.513毫克/毫升劃膜，37"C千燥待用，與結(jié)合墊、樣品墊進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)顯示，選用0.456毫克/毫升包被時(shí)，梯度添加標(biāo)準(zhǔn)品，靈敏度最高，結(jié)果見表1。

2.2標(biāo)記量的確定

微球清洗：50微升熒光微球加入1毫升0.01MMES緩沖液中，混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘;棄上清，加入1毫升0.01MMES緩沖液，混勻離心;重復(fù)上述步驟3次，并用1毫升0.01MMES緩沖液復(fù)溶。微球活化：向清洗后微球加入250微升/毫升EDC緩沖液，混勻，室溫避光反應(yīng)30分鐘;12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄上清，加入1毫升0.01MMES緩沖液，混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。微球標(biāo)記：棄上清，用4毫升0.05MPB9.0進(jìn)行復(fù)溶，均分至4管分別加入0.8微升，1.0微升，1.2微升標(biāo)記抗體（6.2毫克/毫升），室溫避光反應(yīng)30分鐘。微球封閉：各加入100微升1M甘氨酸溶液混勻，室溫避光反應(yīng)15分鐘;再各加人100微升10%BSA溶液混勻，室溫避光反應(yīng)15分鐘;12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。微球復(fù)溶：將離心后微球用復(fù)溶液復(fù)溶后，按照3微升/厘米噴量噴出。微球標(biāo)記濃度檢測(cè)：與包被膜樣墊組合檢測(cè)結(jié)果顯示，標(biāo)記抗體濃度是1微升/毫升時(shí)，梯度添加標(biāo)誰月靈敏度最高，結(jié)果見表2，由表可知，最佳標(biāo)記量是1微升/毫升。

2.3檢測(cè)結(jié)果分析

2.3.1線性范圍與檢出限取6個(gè)無污染（陰性）精料樣品和6個(gè)無污染（陰性）玉米樣品，分別添加0.00毫克/公斤、0.5毫克/公斤、1毫克/公斤、2毫克/公斤、4毫克/公斤、8毫克/公斤的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次，以添加濃度為為縱坐標(biāo)，以熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如計(jì)算得出糧食谷物的線性范圍，0.5～8毫克/公斤，回歸方程，y=0.99x-0.031相關(guān)系數(shù)，R2=0.998。

2.3.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析在用國標(biāo)法測(cè)定為0的不同種類空白樣品中分別添加嘔吐毒素濃度為0.00毫克/公斤、0.5毫克/公斤、1毫克/公斤、2毫克/公斤、4毫克/公斤、8毫克/公斤的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見表3。

從表3可以看出，嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條測(cè)試不同糧食谷物中嘔吐毒素的添加回收率在92.7%～105%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.4%以內(nèi)。

2.3.3與ELISA方法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果取玉米粉、高梁、棉籽、甜菜粕、青貯玉米受污染樣品各1份，先采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定，再使用嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)定，各測(cè)試3個(gè)平行樣。檢測(cè)結(jié)果如下。

表4表明在不同的糧食谷物飼料中，嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙與ELISA的符合率為95.7%～98.2%，3次重復(fù)的變異系數(shù)CV在11%以內(nèi)。

2.4方法特異性

選擇其他5種常見的真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加，添加的濃度為1000微克/公斤，然后用嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值。結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素的交叉反應(yīng)率均《5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條對(duì)赭曲霉毒素A，伏馬菌素B，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以滿足檢測(cè)要求。

3結(jié)論

本研究研發(fā)了一種嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條，通過對(duì)不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測(cè)試，該產(chǎn)品的最低檢出限為0.5毫克/公斤，線性范圍為0.5～8毫克/公斤，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.7%～ll1.87%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.4%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均《5%。其準(zhǔn)確性和可靠性可以滿足我國對(duì)嘔吐毒素的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡(jiǎn)單快速、誰確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食谷物飼料中嘔吐素的快速定量檢測(cè)分析。