修志靜，管非凡，諸葛祥林，王一鳴，楊海靈

（北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

赤霉素（Gibberellins，GAs）是一類廣泛存在的重要植物激素。GAs的生物合成與代謝途徑研究已經(jīng)有近百年，取得了突破性進(jìn)展[1]。GAs參與植物生長發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過程，比如赤霉素可以促進(jìn)植物莖節(jié)間細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞長度增加而節(jié)間數(shù)不變，從而實(shí)現(xiàn)莖的伸長[2-3]，赤霉素還可以促進(jìn)下胚軸伸長、葉的伸展和葉片擴(kuò)大、花的開放、根的生長、表皮毛狀體的發(fā)育、果實(shí)和種子的發(fā)育和成熟等[4-7]。在生產(chǎn)中，赤霉素也有廣泛的應(yīng)用，如促進(jìn)農(nóng)作物的生長和早熟、提高作物產(chǎn)量、打破種子休眠并增加發(fā)芽率、延長貯藏期、改變雌雄花比例、增加種子產(chǎn)量等[8]。林木相關(guān)研究表明，赤霉素能影響樹木次生木質(zhì)部細(xì)胞的分化，從而在木材形成的過程中發(fā)揮作用[9]。

赤霉素的生物合成與代謝是由多種酶參與的多步驟酶促反應(yīng)過程，它在植物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡是由多種因素直接或間接調(diào)控的[10]。前饋調(diào)節(jié)和反饋調(diào)節(jié)是赤霉素合成和代謝途徑主要的調(diào)控方式，通過調(diào)控赤霉素合成代謝關(guān)鍵步驟的酶活性從而實(shí)現(xiàn)對(duì)赤霉素合成代謝的控制[11]。GAs合成代謝通路上涉及的關(guān)鍵酶主要來源于3個(gè)基因家族：萜烯合成酶基因家族（TPSs）、細(xì)胞色素P450單加氧酶基因家族（P450s）和2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶基因家族（2ODD）。其中，2ODD基因家族的GA氧化酶（GAox）是赤霉素合成和調(diào)控的關(guān)鍵酶，它們主要負(fù)責(zé)催化不同GAs之間的相互轉(zhuǎn)化[11]。根據(jù)酶催化反應(yīng)作用的碳原子位置的不同，GAox又可以分類為GA2ox、GA3ox和GA20ox等幾個(gè)亞家族[12]。GA20ox和GA3ox可以催化沒有活性的赤霉素GA12和GA53生成具有生物活性的赤霉素GA1和GA4，提高植物體內(nèi)具有生物活性的GAs的水平，而GA2ox是GAs降解過程中的關(guān)鍵酶，它可以使植物體內(nèi)具有生物活性的GAs及其前體和其他中間產(chǎn)物分解失活，從而降低植物體內(nèi)具有生物活性的GAs的水平[13]。到目前為止，大多數(shù)研究專注于GA2ox、GA20ox和GA3ox，過量表達(dá)的GA20ox會(huì)增加植物根的長度以及數(shù)量[14]，GA20ox和GA3ox的功能缺失突變體可以產(chǎn)生矮化的表型[15-19]，同樣過表達(dá)GA2ox也可以導(dǎo)致植物出現(xiàn)矮化的表型[13,20]。

毛果楊Populus trichocarpa是完成全基因組測(cè)序的第一個(gè)林木樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，是林木模式植物[21]。在木本植物毛果楊中，參與赤霉素合成通路的GAox基因還沒有得到系統(tǒng)解析。因此，本研究選擇毛果楊GAox基因家族為研究對(duì)象，整合基因組定位、基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)模式和酶生化活性等數(shù)據(jù)，探究木本植物GAox基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系和功能分化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

毛果楊植株，由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曾慶銀課題組惠贈(zèng)。

1.2 ODD基因家族的鑒定

以擬南芥Arabidopsis thalianaODD基因家族成員的蛋白質(zhì)序列為模板，通過TBLASTN搜索，分別在Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)和PLAZA (https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/）下載得到膠球藻C-169（Coccomyxa subellipsoideaC-169）、毛果楊和水稻Oryza sativa基因組中ODD基因家族成員的序列信息。使用NCBI的Conserved Domains數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。

1.3 毛果楊GAox基因家族進(jìn)化分析

利用MUSCLE（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）對(duì)來自膠球藻C-169、擬南芥、水稻和毛果楊ODD基因家族的序列進(jìn)行比對(duì)分析，并用BioEdit進(jìn)行調(diào)整。利用IQ-TREE-1.6.7軟件（http://www.iqtree.org/）構(gòu)建最大似然法（Maximum Likelihood，ML）系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]，Bootstrap設(shè)為1 000，最后用MEGA7對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行編輯。

1.4 毛果楊GAox基因家族基本特征和亞細(xì)胞定位分析

利用在線軟件ExPASy中的pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)PtGAox相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)[23]。利用WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測(cè)PtGAox基因家族的亞細(xì)胞定位。

1.5 毛果楊GAox基因家族基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式分析

利用GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析GAox基因CDS序列和基因組序列，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。在PopGenIE (http://v2.popgenie.org/)下載毛果楊GAox基因在成熟葉片、根、節(jié)間、幼葉以及節(jié)5個(gè)部位的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用HemI軟件(http://hemi.biocuckoo.org/)繪制毛果楊GAox基因表達(dá)模式熱圖。

1.6 毛果楊GAox基因家族表達(dá)與純化

利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取毛果楊的總RNA，用FastQuant cDNA第一鏈合成的試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增得到目的基因，連接到pET32a載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)并測(cè)序確認(rèn)。確認(rèn)正確的菌株在含羧芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.5 h加入終濃度為0.06 mmol IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，16 ℃，150 r/min，過夜培養(yǎng)，離心收集菌體（10 000 g/min，3 min，4℃）。用緩沖液A（20 mmol/L 磷酸鈉，0.5 mol/L氯化鈉，20 mmol/L咪唑，pH值7.4）重懸菌體，進(jìn)行超聲波破碎裂解。通過鎳離子親和層析柱對(duì)破碎上清進(jìn)行純化，用緩沖液B（20 mmol/L磷酸鈉，0.5 mol/L氯化鈉，200 mmol/L咪唑，pH值7.4）洗脫目的蛋白。

1.7 毛果楊GAox蛋白酶活測(cè)定及三維結(jié)構(gòu)模擬

毛果楊GAox基因家族的蛋白生化性質(zhì)測(cè)定參照Martin DN等方法[24]，反應(yīng)體系包括：245 μL的100 mmol的 反 應(yīng) 液（Tris-HCl pH值7.4，4 mmol 抗壞血酸，4 mmol 2-酮戊二酸，4 mmol DTT，0.5 mmol 硫酸亞鐵，2 mg/mL牛血清蛋白和1 mg/mL過氧化氫），10 μL底物（溶于甲醇），10 μL純化后的酶。30 ℃反應(yīng)1 h后加入25 μL的乙酸終止反應(yīng)，加入等體積的乙腈進(jìn)行萃取，然后 通 過LC-MS-MRM（AB Sciex QTRAP? 5500 LC/MS/MS）分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析。在SWISS-MODEL網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org）中分析GAox蛋白的三維結(jié)構(gòu)，最后利用Discovery Studio 4.5 Client軟件進(jìn)行調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊GAox基因家族的鑒定

為了鑒定毛果楊基因組中參與赤霉素代謝通路的2ODD基因，在PLAZA數(shù)據(jù)庫中搜索并下載得到71個(gè)擬南芥、78個(gè)水稻、124個(gè)毛果楊2ODD基因家族成員的蛋白序列。使用IQTREE-1.6.7，以來自膠球藻C-169（Coccomyxa subellipsoideaC-169）的3個(gè)ODD基因?yàn)橥忸惾簶?gòu)建了276個(gè)2ODD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。擬南芥和水稻2ODD基因家族分別有16個(gè)和12個(gè)GAoxs基因參與赤霉素代謝通路[12]。系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類結(jié)果支持與擬南芥和水稻GAoxs基因聚在一枝的27個(gè)毛果楊2ODD基因?yàn)槊麠頖Aoxs基因。利用CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)27個(gè)毛果楊GAox基因編碼蛋白質(zhì)都含有2ODD基因家族特有的2OG-FeⅡ_Oxy結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步證明它們屬于2ODD基因家族[11,25]。因此最終確定這27個(gè)GAoxs基因?yàn)槊麠?ODD基因家族中參與赤霉素代謝通路的關(guān)鍵基因。

2.2 毛果楊GAox基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

前人研究指出2ODD基因家族分成不少于8個(gè)亞家族，其中至少4個(gè)亞家族直接參與高等植物赤霉素代謝通路，即GA3ox、C19-GA2ox、C20-GA2ox和GA20ox亞家族[26]。擬南芥、水稻和毛果楊所有2ODD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚類分析支持將ODD基因家族分成9個(gè)不同的亞類（Class I - Class IX）。其中Class I包含4個(gè)AtGA3ox，Class II和IV分別包含5個(gè)和4個(gè)AtGA2ox，Class III包含5個(gè)AtGA20ox。根據(jù)底物特異性，GA2ox基因分成C19-GA2ox基因和C20-GA2ox基因兩類[27]。前人的研究指出，Class II的3個(gè)擬南 芥AtGA2oxs蛋 白（AtGA2ox1，AtGA2ox2，AtGA2ox3）能催化C19-GAs[28]，屬于C19-GA2ox，而Class IV的AtGA2ox7與AtGA2ox8能夠催化C20-GAs 前體[29]，屬于C19-GA2ox。因此，3個(gè)物種ODD基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的Class I、II、III、IV分別代表GA3ox、C19-GA2ox、GA20ox和C20-GA2ox這4個(gè)亞家族。本研究根據(jù)以上的聚類結(jié)果將毛果楊27個(gè)GAoxs基因命名為GA3ox1-4、GA20ox1-8、GA2ox1-15（圖1B—E）。

圖1 水稻、擬南芥和毛果楊2ODD基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 2ODD gene family from rice, Arabidopsis and Populus

2.3 毛果楊GAox基因家族的序列特征

毛果楊GAox基因編碼蛋白質(zhì)長度為322～385個(gè)aa，編碼氨基酸最長的是PtGA20ox7和PtGA20ox8。PtGA20ox7的相對(duì)分子質(zhì)量最大，為44.06 kDa；PtGA2ox4的相對(duì)分子質(zhì)量最小，為35.77 kDa。27個(gè)毛果楊GAox蛋白的理論等電點(diǎn)為5.24～8.73。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，12個(gè)PtGAox蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)，12個(gè)PtGAox蛋白定位在細(xì)胞核，3個(gè)PtGAox蛋白定位在葉綠體，PtGA2ox11和PtGA20ox7定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，PtGA3ox2定位在線粒體，PtGA2ox7定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體。27個(gè)PtGAox基因編碼蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)它們都含有與Fe結(jié)合的2個(gè)組氨酸殘基（H）和1個(gè)天冬氨酸（D）殘基（圖2，三角形），與2-酮戊二酸的5-羧基基團(tuán)結(jié)合的精氨酸（R）殘基和絲氨酸（S）殘基（圖2，菱形），活性位點(diǎn)比較保守。

2.4 毛果楊GAox基因家族的染色體定位

圖2 毛果楊GAox蛋白活性中心附近氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment near the active center of GAox protein

表1 PtGAox基因家族的序列信息Table 1 Sequence information of PtGAox gene family

本研究繪制了毛果楊基因組中參與赤霉素代謝通路的GAox基因家族成員的染色體定位圖，楊樹最近一次全基因組重復(fù)事件后染色體重排產(chǎn)生的同源染色體片段用線性表示，染色體分別由對(duì)應(yīng)的數(shù)字（1～19）進(jìn)行編號(hào)。毛果楊GAox基因家族的27個(gè)GAoxs基因分散定位在毛果楊19條染色體中的14條染色體上，第9、13、16、17、19染色體上沒有任何GAoxs基因（圖3）。在27個(gè)PtGAox基因中，有11對(duì)GAoxs基因（PtGA3ox1, 2;PtGA3ox3, 4; PtGA2ox1, 2; PtGA2ox4, 5; PtGA2ox6,7; PtGA2ox8/9, 10;PtGA2ox11, 12; PtGA2ox13,14;PtGA20ox1, 2;PtGA20ox5, 6; PtGA20ox7, 8）位于染色體共線區(qū)域內(nèi)，可能來源于基因組的大片段重復(fù)。在5號(hào)和11號(hào)染色體上各有一個(gè)基因簇（PtGA20ox3, 4;PtGA2ox8, 9），可能來源于基因的串聯(lián)重復(fù)。而PtGA2ox3和PtGA2ox15既不能在同源染色體片段上找到對(duì)應(yīng)的大片段重復(fù)基因，又沒有形成基因簇，分別分散在4和1號(hào)染色體上。

2.5 毛果楊GAox基因家族基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式分析

本研究探討了27個(gè)毛果楊GAoxs基因在成熟葉片、根、節(jié)間、幼葉及節(jié)5個(gè)部位的表達(dá)模式，其中有3個(gè)基因（PtGA2ox8, PtGA2ox10和PtGA2ox12）沒有搜索到表達(dá)數(shù)據(jù)（圖4B）。毛果楊有8個(gè)GAoxs基因在成熟葉片中的表達(dá)量比在根、節(jié)間、幼葉和節(jié)的表達(dá)量高，而有9個(gè)、3個(gè)、3個(gè)和1個(gè)GAoxs基因分別在幼葉、根、節(jié)間和莖的表達(dá)量最高。在成熟葉中PtGA2ox1的表達(dá)量最高，而在其他4個(gè)部位PtGA2ox7表達(dá)量最高，這兩個(gè)基因都屬于C19-GA2ox亞家族。而同一個(gè)亞家族的另外5個(gè)基因（PtGA2ox2, 3, 4, 5和6）在5個(gè)部位的表達(dá)量又比較低，因此基因表達(dá)在C19-GA2ox亞家族發(fā)生了分化。GA3ox亞家族的4個(gè)基因在5個(gè)部位均有較高量的表達(dá)，其中PtGA3ox2在5個(gè)部位的表達(dá)量均高于PtGA3ox1、PtGA3ox3和PtGA3ox4。不同亞家族的GAoxs基因在5個(gè)部位的表達(dá)發(fā)生了分化。

圖3 毛果楊GAox基因的染色體定位Fig.3 Genomic localization of Populus GAox genes

圖4 毛果楊GAox基因家族基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式Fig.4 Gene structure and expression pattern of Populus GAox gene family

根據(jù)基因外顯子和內(nèi)含子長度，本研究繪制27個(gè)GAoxs基因的基因結(jié)構(gòu)（圖4C）。GA3ox亞家族和GA2ox亞家族的基因都具有3個(gè)外顯子/兩個(gè)內(nèi)含子的基因結(jié)構(gòu)，GA20ox亞家族包含兩種基因結(jié)構(gòu)，PtGA20ox1和PtGA20ox2含有4個(gè)外顯子，其余的GA20ox基因含有3個(gè)外顯子/兩個(gè)內(nèi)含子。同一個(gè)亞家族不同成員的基因結(jié)構(gòu)有不同的模式，如GA3ox亞類的PtGA3ox1,PtGA3ox2和PtGA3ox4的結(jié)構(gòu)相似度較高，而PtGA3ox3的內(nèi)含子長度有明顯差異。因此27個(gè)GAoxs基因的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了分化。

2.6 毛果楊GAox基因家族的生化活性

本研究成功構(gòu)建得到18個(gè)PtGAox基因的重組表達(dá)載體pPET32a/PtGAox (PtGA3ox1, 2, 3,PtGA2ox1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 13, 14, PtGA20ox2, 3, 4,5, 6, 7, 8)，SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)PtGAoxs蛋白（PtGA2ox3, 5, PtGA2ox8, 13, 14, PtGA20ox6, 7,8）為可溶性蛋白，6個(gè)PtGAox蛋白（PtGA2ox1,4, 6, 7, PtGA20ox2, 5）為包涵體，4個(gè)PtGAox蛋白（PtGA3ox1, 2, 3, PtGA20ox3）不表達(dá)。通過親和層析對(duì)5個(gè)PtGAox蛋白進(jìn)行了純化，包括C19-GA2ox亞家族的PtGA2ox3和PtGA2ox5，GA20ox亞 家 族 的PtGA20ox6、PtGA20ox7和PtGA20ox8。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）對(duì)純化得到的蛋白進(jìn)行了底物活性測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品LC-MS全掃描結(jié)果確定酶學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物MRM定量分析時(shí)需要采集的母離子和子離子分別為：GA8，363.1/275.2；GA51，331.2/287.2；GA9，315.2→271.2；GA20，331.2→287.2；GA24，345.2→257.4（圖5）。

酶活性測(cè)定的結(jié)果顯示C19-GA2ox亞家族的兩個(gè)蛋白對(duì)底物GA1和GA9有活性，催化GA1生成GA8，GA9生成GA51，而GA20ox亞家族的3個(gè)蛋白對(duì)底物GA15, GA24和GA53有活性，催化GA15生成GA24，GA24生成GA9，GA53生成GA20（表2）。與PtGA2ox5相比，PtGA2ox3對(duì)GA9的活性最高，活性為8.015 nmol·min-1mg-1。GA20ox亞家族的3個(gè)蛋白對(duì)底物GA15和GA53均表現(xiàn)出微弱的活性，而對(duì)底物GA24有較高的活性。其中PtGA20ox6對(duì)底物GA24的活性最高，酶活性為2.862 nmol·min-1mg-1。

蛋白活性與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，因此本研究對(duì)5個(gè)毛果楊GAox蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，與Huang等人[26]的研究結(jié)果十分相似，這5個(gè)蛋白主要由α螺旋和β折疊組成，而且所有的特征序列與底物結(jié)合的位點(diǎn)都位于縫隙中，三級(jí)結(jié)構(gòu)差異不明顯（圖6）。

3 結(jié)論與討論

赤霉素是植物體內(nèi)的重要的激素之一，GAox基因家族是赤霉素合成途徑的關(guān)鍵酶之一[30-32]。本研究在毛果楊基因組中一共鑒定得到27個(gè)GAox基因，分散分布在毛果楊14條染色體上。通過比較不同亞家族擬南芥和毛果楊GAox基因數(shù)量，發(fā)現(xiàn)GAox基因家族在毛果楊中發(fā)生了不同程度的擴(kuò)張，比如C20-GA2ox亞家族含有4個(gè)擬南芥GAox基因和8個(gè)毛果楊GAox基因。在毛果楊中，有11對(duì)GAox基因是通過全基因組加倍產(chǎn)生的，因此其擴(kuò)張主要是由于大片段重復(fù)產(chǎn)生的。PtGA20ox7和PtGA20ox8是由全基因組重復(fù)產(chǎn)生的一對(duì)重復(fù)基因，PtGA20ox8在5個(gè)組織部位的表達(dá)量均明顯高于PtGA20ox7，而酶學(xué)活性測(cè)定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因編碼的蛋白對(duì)底物GA15和GA53均表現(xiàn)出微弱的活性，而對(duì)底物GA24有較高的活性，而且PtGA20ox8對(duì)GA24的活性是PtGA20ox7的兩倍。因此表達(dá)模式和生化活性的分化可能是全基因組重復(fù)發(fā)生后這兩個(gè)基因均得以保留的機(jī)制。有兩個(gè)基因（PtGA2ox3,PtGA2ox15）在同源染色體片段上沒有找到對(duì)應(yīng)的大片段重復(fù)基因，這表明對(duì)應(yīng)的同源序列可能在重復(fù)事件后已經(jīng)丟失，支持全基因組重復(fù)事件之后加倍的基因拷貝有丟失的傾向[33]。

目前可知，GA2ox可以調(diào)節(jié)植物由營養(yǎng)生長到生殖生長，在植物開花以及果實(shí)成熟時(shí)含量較高[27-28]，GA3ox在發(fā)育中的種子和未成熟的果實(shí)中含量較高[34]，GA20ox在節(jié)、幼芽、萌發(fā)的胚中含量較高[35]。在毛果楊中有8個(gè)GAoxs基因在成熟葉片中的表達(dá)量比在根、節(jié)間、幼葉和節(jié)的表達(dá)量高，而且成熟葉片中表達(dá)量最高的3個(gè)基因是PtGA2ox1、PtGA2ox7和PtGA2ox15，都屬于GA2ox亞家族，GA2ox是GAs降解過程中的關(guān)鍵酶，它可以使植物體內(nèi)具有生物活性的GAs水平降低，因此這與成熟葉片中活性GAs水平降低是一致的[36]。而GA3ox亞家族4個(gè)基因中的3個(gè)基因在毛果楊的幼葉中表達(dá)量最高，GA3ox可以催化沒有活性的赤霉素GA53生成具有生物活性的赤霉素GA4，提高植物體內(nèi)具有生物活性的GAs的水平，因此這與幼葉中活性GAs水平較高是一致的[36]。

圖5 PtGAox蛋白反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)C-MS-MRM定量分析Fig.5 Quantitative analysis of the products catalyzed by PtGAox proteins by LC-MS-MRM

表2 毛果楊C19-GA2ox和GA20ox亞家族蛋白底物活性?Table 2 Enzymatic activity of Populus C19-GA2ox and GA20ox subfamily proteins

圖6 毛果楊C19-GA2ox和GA20ox蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬Fig.6 Structure modeling of Populus C19-GA2ox and GA20ox proteins

在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，毛果楊的PtGA2ox3與擬南芥的AtGA2ox2和AtGA2ox3聚為一支，同源關(guān)系比較近；而毛果楊的PtGA2ox5與擬南芥的AtGA2ox4同源關(guān)系比較近。1999年Thomas等克隆并測(cè)定了AtGA2ox2、AtGA2ox3催化C19底物GA1、GA9的活性，發(fā)現(xiàn)AtGA2ox2對(duì)底物GA1有2β-羥基化氧化酶催化能力，對(duì)底物GA9有2-酮基化氧化酶的催化能力；而AtGA2ox3對(duì)上述兩底物有2β-羥基化氧化酶催化活性[28]。目前擬南芥GA2ox家族成員AtGA2ox4對(duì)C19底物的特異性催化未見報(bào)到。本實(shí)驗(yàn)克隆獲得了AtGA2ox2、AtGA2ox3的 同 源 蛋 白PtGA2ox3，AtGA2ox4的同源蛋白PtGA2ox5。體外酶活測(cè)定表明，PtGA2ox3對(duì)底物GA9有很高的催化活性，PtGA2ox5對(duì)底物GA9的催化活性較低。從模擬的三維結(jié)構(gòu)上看，二者具有相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)。從活性位點(diǎn)附近一級(jí)序列比對(duì)來看，兩者差別很大。PtGA2ox3蛋白在結(jié)合2-酮戊二酸的活性位點(diǎn)R和S附近以非極性氨基酸丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及苯丙氨酸為主，疏水環(huán)境增強(qiáng)了底物與活性中心R和S的靜電作用力，促進(jìn)了催化基團(tuán)與底物反應(yīng)基團(tuán)之間的正確定位和取向。而PtGA2ox5蛋白在活性位點(diǎn)R和S附近存在多個(gè)帶羥基的氨基酸（蘇氨酸，絲氨酸，酪氨酸），這些極性富電子基團(tuán)與底物的羰基、羧基形成大量氫鍵，穩(wěn)定了底物構(gòu)象，抑制了底物扭曲形變，降低了酶活性中心的催化能力。推測(cè)PtGA2ox3活性中心位置附近的非極性基團(tuán)是引起其催化活性高的原因，這雖然符合生物化學(xué)原理，仍然需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

前人對(duì)赤霉素代謝途徑的研究主要集中在水稻、擬南芥以及一些草本植物[26,37]，很少有關(guān)于木本植物的研究，本研究主要對(duì)毛果楊GAox基因家族進(jìn)行了鑒定、分類、表達(dá)模式和酶學(xué)活性測(cè)定，可為進(jìn)一步研究毛果楊赤霉素代謝途徑提供參考。